miR-520b对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制研究

发布时间：2018-03-28 23:27

  本文选题：微小RNA　切入点：膀胱癌　出处：《浙江大学》2014年博士论文

【摘要】：[背景] 膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,但其发病机制复杂,涉及许多基因表达、功能异常及多种信号通路的改变。当前,膀胱癌发生、发展的分子遗传学机制尚不清楚。 MicroRNA是在真核生物中发现的一种内源性的具有调控功能的非编码单链小分子RNA,大小约21-25个核苷酸,通常在转录后水平调控基因表达。许多研究表明,microRNA参与肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、侵袭、转移及等各个环节。microRNA在膀胱癌细胞中也存在的异常表达,其可能在肿瘤发生与发展过程中起着重要的作用。 miR-520b是最近发现的一种在肿瘤中异常表达的重要microRNA.初步研究发现,其在多种恶性肿瘤(包括膀胱癌在内)中表达显著下调,我们推测其对膀胱癌可能有抑癌作用。 [目的] 本论文探讨了miR-520b在膀胱癌发生、发展中的生物学功能,并对其相关的分子作用机制进行深入的研究。 [方法] 1。在18对配对的组织标本中进行miR-520b的相对表达量检测,并统计分析miR-520b在膀胱癌及癌旁膀胱粘膜组织中的表达差异,以及tniR-520b表达量与膀胱癌不同组织病理分期及分级之间的关系；RT-PCR验证]miR-520b在膀胱癌细胞系(T24、UC3)与永生化人正常膀胱粘膜上皮细胞株SV-HUC-1的表达差异。 2.通过体外转染miR-520b mimic的方式来进行获得性功能实验。上调miR-520b在膀胱癌细胞系T24、UC3中的表达,以CCK8、平板克隆形成、流式细胞周期检测等体外实验验证miR-520b对膀胱癌细胞增殖的影响。以划痕实验以及Transwell小室迁移和侵袭来分析miR-520b过表达对细胞迁移、侵袭的影响； 3.运用生物信息学方法,预测miR-520b可能的下游靶基因,并对预测的靶基因进行功能聚类分析,结合文献、预实验验证等方法,初步判断Cyclin D1可能是miR-520b的靶基因之一。利用Western Blot等进行靶蛋白表达量的验证,利用qRT-PCR、双荧光素酶报告系统对miR-520b的作用的靶序列进行鉴定。 [结果] 1.收集的18例膀胱癌组织标本中,有16例为miR-520b相对低表达,占88.9%。癌组织中miR-520b表达量平均约癌旁组织的56%。肌层浸润性膀胱癌与非肌层浸润性膀胱癌以及高级别膀胱癌与低级别膀胱癌在miR-520b的相对表达量的平均值有差异,但在统计学上无显著性意义。 2.膀胱癌细胞株T24和UC3细胞同样存在miR-520b低表达,与永生化的膀胱移行上皮细胞株SV-HUC-1相比,T24细胞和UC3细胞中]miR-520b的表达量均约为SV细胞的1／2。 3.通过对T24细胞和UC3细胞转染miR-520b mimic来过表达细胞中的miR-520b,可以抑制其生长。其抑制率呈现浓度依赖性,在50nM miR-520b mimic处理48小时后,T24细胞和UC3细胞的抑制率分别达到31.8%和34.0%。流式细胞周期检测发现miR-520b mimic处理可以诱导T24细胞和UC3发生G1期阻滞,50nM miR-520b mimic作用48小时后,T24细胞和UC3细胞G1期的比例分别增加12%和19%。而50nM miR-520b mimic作用48小时后,流式细胞凋亡检测提示miR-520b过表达并不能诱导细胞凋亡。miR-520b过表达可以抑制T24细胞和UC3细胞体内外克隆形成能力。体外平板克隆形成实验显示,miR-520b过表达使T24细胞和UC3的克隆形成率分别下降7.5%(从18%降到10.5%)和10.6%(从21.8%降到11.2%)。划痕实验、Transwell小室实验提示miR-520b过表达不能抑制T24细胞和UC3细胞的侵袭和迁移。 4.我们在T24细胞和UC3细胞中检测到Cyclin D1、CDK4、pRb和E2F3在miR-520b过表达后在蛋白水平有下调。进一步行RT-PCR分析和双荧光素酶报告系统分析证实Cyclin D1是miR-520b的直接作用靶点,其3-UTR中存在miR-520b调控的作用序列。 [结论] 1与正常组织和细胞相比,膀胱癌组织和细胞中miR-520b的表达量呈现显著下调。但是本研究未能提示miR-520b表达量高低与膀胱癌的分级、分期相关。 2.过表达miR-520b使得膀胱癌细胞T24和UC3细胞发生细胞周期G1期阻滞及增殖显著抑制。同时,miR-520b的过表达还削弱了T24细胞和UC3细胞的克隆形成能力。 3. Cyclin D1是确认的microRNA-520b在膀胱癌细胞中的直接调控靶基因。
[Abstract]:[background]
Bladder cancer is one of the most common malignant tumors in humans, but its pathogenesis is complex. It involves many gene expression, dysfunction and multiple signaling pathways. Currently, the molecular genetic mechanism of bladder cancer occurrence and development is not clear.
MicroRNA is a kind of endogenous found in eukaryotes with regulatory function of non encoding small single stranded RNA, the size of about 21-25 nucleotides, usually expressed in post transcriptional regulation genes. Many studies indicate that microRNA is involved in tumor cell differentiation, proliferation, apoptosis, invasion, metastasis and abnormal expression of.MicroRNA links etc. there are also in bladder cancer cells and its possible in tumor genesis and development plays an important role in the process.
MiR-520b is a recently discovered microRNA., which is abnormally expressed in cancer. Its preliminary study shows that its expression is down regulated in many kinds of malignancies, including bladder cancer. We speculate that it may have a tumor suppressor effect on bladder cancer.
[Objective]
In this paper, the biological functions of miR-520b in the development of bladder cancer were discussed, and the mechanism of its molecular action was studied.
[method]
The relative expression of 1. miR-520b in 18 paired tissue samples were determined and analyzed the differential expression of miR-520b in bladder cancer and adjacent bladder mucosa tissues, and the expression of tniR-520b between different pathological tissue volume and bladder cancer staging and grading of the relationship; RT-PCR verification of]miR-520b in bladder cancer cell lines (T24. UC3) differential expression of immortalized human normal bladder epithelial cell line SV-HUC-1.
2. by in vitro transfection of miR-520b mimic to gain of function experiments. The upregulation of miR-520b in bladder cancer cell line T24, the expression of UC3, in CCK8, colony formation, effect of FCM in vitro experiments of miR-520b on the proliferation of bladder cancer cells. The scratch test and Transwell chamber migration and invasion. Analysis of miR-520b over expression on cell migration, invasion and influence;
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本文编号：1678558