高糖对肾组织干细胞的影响及其损伤机制初探

发布时间：2018-03-29 23:23

  本文选题：肾组织干细胞　切入点：高糖　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文

【摘要】：目的：从大鼠肾乳头处分离培养肾组织干细胞(KSC)，鉴定其生物学特征及干细胞特性。评估高糖对KSC基本特征、旁分泌作用及向肾小管上皮细胞（RTEC）分化能力的影响。 方法：①从4周龄雄性SD大鼠双肾肾乳头部位分离培养KSC，观察细胞形态特征，通过细胞流式、免疫荧光鉴定KSC的表型特征，通过成骨、成脂诱导分化鉴定其分化能力，并通过qRT-PCR比较KSC与RTEC基因表达的差异。②比较KSC在高糖（30mmol/L）和正糖（5.6mmol/L）培养基的微环境下细胞形态、增殖能力、相关表型标记物、趋化因子表达及耐缺氧能力的差异。③分别用正糖和高糖培养基对KCS进行预处理后制备KSC上清，建立大鼠RTEC缺氧/复氧（H/R）模型，比较高糖与正糖KSC上清对H/R RTEC修复作用的差异。④对KSC进行诱导分化，比较两种诱导方案诱导效率的差异；将KSC分别用高糖和正糖培养基预处理4d，然后按照共培养方案进行诱导，比较两种KSC经诱导后成熟上皮细胞标记物E-Cad、CK-18、AQP-1表达的差异。 结果：①KSC主要呈纺锤形或树枝状生长，免疫荧光结果显示可表达α-SMA、Vimentin、N-Cadherin、Nestin、CD133，不表达E-Cadherin、CK-18、ZO-1，细胞流式结果CD29、CD90、CD73、CD45表达比率分别为99%、95.8%、99.9%和3.4%，干细胞标记CD133和Nestin,阳性率分别为33.2%和70.2%，双阳性率为31.4%，成脂诱导后油红O染色呈红色，成骨诱导后茜素红染色呈橙红色，Von kossa染色成黑色，qRT-PCR结果显示：与RTEC相比，原始胚胎干细胞标记物Nanog、Oct4/pou5f1、Sox2/sry-box-2和间质标记物-SMA、Vimentin的mRNA表达量在KSC中显著增高（P 0.01）,而成熟的上皮细胞标记物E-Cadherin、CK18的mRNA表达量在KSC中显著降低（P 0.01）。②细胞增殖检测结果提示从第4天开始高糖组细胞生长较正糖组缓慢，免疫荧光结果提示KCS经高糖处理后，纤维连接蛋白（Fibronectin）、I型胶原（Collagean I）、IV型胶原（Collagean IV）的合成增加；qRT-PCR检测结果显示KSC经高糖干预后，Fibronectin、Collagean I、Collagean IV mRNA表达增高，间质标记物-SMA、Vimentin基因表达进一步升高，促纤维化因子TGF-、CTGF、PAI-1mRNA表达均升高；经高糖预处理96h后，KSC耐缺氧能力下降，低氧培养24h细胞分裂增殖指数低于正糖KSC，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4的基因表达均显著降低（P0.01）。③缺氧4h/复氧2h为RTEC H/R模型最佳时间，缺氧后，RTEC凋亡率升高，上清的LDH和MDA水平升高（P0.01），SOD水平降低（P0.01）。进行KSC上清干预12h和24h后，与对照组相比，正糖组和高糖组RTEC的凋亡率均明显降低，LDH和MDA水平均显著降低（P0.01），SOD水平均显著升高（P0.01）。正糖组和高糖组两组间比较，高糖组RTEC的凋亡率略高于正糖组，LDH和MDA水平要高于正糖组（P0.05），SOD水平要显著低于高糖组（P0.01）。④细胞因子诱导的同时与缺氧损伤的RTEC共培养诱导后，CK-18阳性率最高，为44.2%，成熟上皮细胞标记CK-18、E-Cadherin、ZO-1部分阳性表达。正糖KSC和高糖KSC经共培养方案进行诱导后，细胞流式结果提示，高糖KSC诱导组CK-18阳性率显著低于正糖组（P=0.045）；qRT-PCR结果提示，高糖KSC诱导组成熟上皮细胞标志E-cadherin、AQP-1基因表达水平显著低于正糖组（P0.05）。 结论：①肾乳头部位可以分离培养出具有间充质干细胞特性的KSC②KSC在高糖的微环境中细胞增殖能力下降，促纤维化基因表达增高、对缺氧的耐受能力降低、趋化因子的表达量也降低。③KSC上清对缺氧损伤的RTEC有修复作用，这种作用主要是通过抑制细胞凋亡、减少氧化应激来实现的，而经过高糖预处理的KSC上清的抗凋亡、抗氧化应激作用减弱。④KSC在体外可以诱导分化为RTEC，，细胞因子诱导的同时与缺氧损伤的RTEC共培养为最佳诱导方案，高糖使KSC向RTEC分化的诱导效率降低。
[Abstract]:Objective : To isolate and culture kidney tissue stem cells ( KSC ) from rat renal papilla and to identify their biological characteristics and stem cell characteristics .

Methods : 鈶

本文编号：1683329