Klotho抑制尿毒症毒素诱导左室肥厚的作用和机制研究

发布时间：2018-04-02 13:18

本文选题：硫酸吲哚酚　切入点：Klotho　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景及意义尿毒症心肌病(Uremic Cardiomyopathy)是慢性肾病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者最常见的并发症和死亡原因。左室肥厚(Left Ventricular Hypertrophy, LVH)是尿毒症心肌病最显著的病变特征,既往研究表明高血压和容量负荷增加是左室肥厚的重要诱因,但控制血压和减轻容量负荷并不能阻止CKD患者LVH的持续进展。近年来的研究则更加关注CKD患者特殊的内环境改变与心血管并发症的关系,而氧化应激在其中的作用显得尤为突出,研究证实氧化应激是导致LVH的一个重要因素。与普通人群不同,CKD患者长期处于高氧化应激状态,这与患者肾功能减退后体内大量毒素蓄积有关,特别是硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate, IS)等蛋白结合毒素,可以刺激细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)过量生成、提高机体氧化应激水平,并且常规透析并不能将它们有效清除,于是长时间大量存在于血循环之中,严重危害心血管系统。因此,尿毒症毒素极有可能通过上调机体氧化应激水平促进尿毒症心肌病的发生和发展,而明确尿毒症毒素诱导LVH的作用将从一全新的角度揭示尿毒症心肌病的发病机制,在此基础上探讨有效的防治措施也具有非常重要的临床意义。 Klotho基因是近年来发现的一种抗衰老基因,仅在肾脏、脉络膜和生殖器官等少数组织器官中表达。分泌型Klotho蛋白能够进入血液循环,作为体液因子发挥生理作用。研究发现,Klotho抗衰老作用与其强大的抗氧化应激效应密切相关。Klotho基因过表达的小鼠不但寿命延长,其体内ROS生成量也明显减少。已有研究证实,分泌型Klotho蛋白能够促进胞内超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)生成,加速ROS的清除；该基因转染的高血压大鼠,肾脏和主动脉NADPH氧化酶2(NADPH Oxidase2, NOX2)的表达受抑,超氧化物生成减少,进而延缓肾脏和血管功能的损害。虽然Klotho对氧化应激的影响机制尚未研究透彻,但Klotho抑制ROS生成以及清除过量ROS的功能是肯定的,即分泌型Klotho蛋白是机体一种极为重要的内源性抗氧化应激蛋白。由于Klotho仅在体内有限的组织器官中表达分泌,且主要在肾小管上皮细胞高表达,该基因缺陷小鼠的表型与尿毒症患者极为相似,在短时间内即可快速出现心血管疾病和死亡,因此,Klotho和慢性肾病心血管并发症的关系引起了人们的重视。我们以往的研究证实尿毒症小鼠肾脏Klotho表达和血清Klotho水平均明显下降；而Klotho基因转染的尿毒症小鼠其动脉粥样硬化的病理改变得到了显著改善。这提示在CKD时Klotho表达明显降低,若上调Klotho表达则可以改善CKD的血管病变。晚近研究发现,Klotho基因敲除小鼠存在明显的LVH,其机制并不明确,但这初步说明Klotho与LVH的发生发展有着密切的关系。我们推测,在CKD时尿毒症毒素可能通过提高氧化应激水平诱发LVH；同时,肾脏病变又可导致Klotho蛋白表达和分泌降低,使得机体内源性抗氧化应激能力下降,对尿毒症毒素诱发的LVH的抑制作用减弱,体内这种氧化与抗氧化的失衡可能是CKD时LVH高发和快速进展的原因之一。而上调Klotho表达或外源性补充Klotho蛋白则可能通过提高机体的抗氧化应激水平抑制CKD时LVH的发生和发展,从而改善尿毒症心肌病。为此,本研究以新生大鼠心肌细胞作为体外研究对象,并且以尿毒症模型小鼠和Klotho基因敲除杂合子(kl/+)小鼠作为体内实验对象,分以下4个部分对Klotho干预IS诱导LVH的作用和机制进行了研究：①IS诱导心肌细胞肥大的作用及机制研究；Klotho对IS诱导心肌细胞肥大的干预作用及机制；③通过腹腔注射IS,观察并比较研究kl/+小鼠和正常小鼠LVH情况；④构建尿毒症小鼠模型,观察腹腔注射Klotho对小鼠LVH的影响,明确外源性补充Klotho是否可以减轻尿毒症LVH。研究结果： 1、C57BL/6J小鼠腹腔注射IS(100mg/kg/d)8周后HPLC-FLU法检测小鼠血清IS浓度,发现血清中IS浓度约为对照组小鼠的5倍,而western blot检测提示肾脏Klotho蛋白表达量却明显下降。kl/+小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠腹腔注射IS8周后超声心动图检测发现,kl/+小鼠左心室后壁厚度(Left Ventricular Posterior Wall Thickness, LVPWT)和心体比均显著增加,舒张期左心室内径(Left Ventricular Internal Diameter at End-Diastolel, LVIDD)降低。与WT小鼠相比,kl/+小鼠在IS注射8周后LVH更为明显。上述结果表明,血清IS浓度增加是诱发LVH的原因之一,而IS诱导LVH发生的同时还可以降低肾脏Klotho表达；而一旦机体内Klotho缺乏,IS诱导LVH的作用会进一步增强,提示Klotho可以拮抗IS诱导的LVH。 2、5、50、500μmol/L的IS可以剂量依赖性的增加心肌细胞[3H]-亮氨酸([3H]-leucine)的摄入量,500μmol/L的IS孵育明显增加心肌细胞体积,心肌肥大标志基因ANF、BNP和β-MHC mRNA表达增加,提示IS的确可以诱导心肌细胞肥大。但用400pmol/L Klotho蛋白预处理心肌细胞1h后再给予IS孵育,结果发现,与仅用IS孵育的心肌细胞相比,[3H]-leucine摄入量减少,肥大的心肌细胞体积变小,且心肌肥大标志基因ANF、BNP和β-MHC mRNA的表达明显下调,而ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)亦存在上述作用。说明Klotho和抗氧化剂NAC一样可以拮抗IS诱导的心肌细胞肥大,而抑制氧化应激可以减弱IS促心肌细胞肥大的作用。 3、为了进一步明确IS诱导心肌细胞肥大以及Klotho拮抗该作用的机制,我们继续深化了体外实验研究。结果发现,低剂量IS既能快速促进心肌细胞内ROS生成,500μmol/L IS孵育心肌细胞10min后,ROS水平较对照组增高2倍。而200pmol/L和400pmol/L Klotho、10μmol/L DPI(NADPH氧化酶的抑制剂)和5mmol/L NAC预孵育心肌细胞1h,均能够明显抑制IS诱导的ROS生成增多。与DPI的作用相似,Klotho预孵育可以显著下调IS诱导的心肌细胞NOX2和NOX4高表达。已有报道证实ROS下游信号通路MAPK家族的活化在心肌肥大中发挥着重要作用。我们随后探讨了IS处理后心肌细胞中ROS过量生成和MAPK活化的关系。western blot检测提示,IS孵育心肌细胞15-60min能够刺激p38和ERK1/2的磷酸化,而JNK的变化则不明显,10μmol/L DPI或400pmol/L Klotho预孵育细胞1h则能够显著抑制p38和ERK1/2的磷酸化。与p38和ERK1/2抑制剂(SB203580和U0126)的作用一致,NOX抑制剂DPI预孵育能够明显减慢IS诱导的心肌细胞蛋白合成增加,下调ANF、BNP和β-MHC mRNA表达。这说明IS可能是通过活化ROS/MAPK(p38和ERK1/2)信号通路诱导了心肌细胞肥大,而Klotho可以拮抗该信号通路的活化。结合上述研究结果,我们得出如下结论：IS通过促进NOX2和NOX4来源的ROS生成增强了心肌细胞的氧化应激水平,随后激活了ROS下游的p38和ERK1/2导致了心肌细胞肥大,而Klotho可以通过抑制NOX2和NOX4的表达减少IS诱导的心肌细胞ROS生成和下游信号活化,由于其作用与抗氧化剂NAC和NOX抑制剂DPI一致,故其拮抗IS诱导心肌细胞肥大的作用可能还是通过抗氧化应激而实现的。 4、12周龄BALB/c小鼠行左肾皮质电灼术,2周后再将右肾全切,构建尿毒症小鼠模型。经手术诱导肾功能衰竭(Surgically Induced Renal Failure, SIRF)小鼠建模后第4周,残余肾中Klotho的表达和血清中Klotho的含量明显降低,血清IS浓度明显升高。与假手术(Sham)组相比较,SIRF组小鼠心肌组织NOX2和NOX4的表达显著增高,ROS含量也明显增加。而腹腔注射Klotho蛋白(0.01mg/kg/48h)可以显著抑制SIRF小鼠心肌组织NOX2和NOX4的表达及ROS生成。不仅如此,外源性补充Klotho能够显著改善SIRF小鼠的LVH,与腹腔注射PBS的SIRF小鼠相比,给予Klotho治疗的模型小鼠LVPWT和心体比降低,LVIDD增加,ANF、BNP和β-MHC的mRNA表达水平下调。上述结果示,外源性补充Klotho能够明显改善CKD并发的LVH。研究结论 1、尿毒症毒素是CKD时发生LVH的重要诱因之一,尿毒症毒素IS在诱导LVH发生的同时还可以抑制肾脏抗氧化应激蛋白Klotho的表达,而Klotho缺乏可以进一步加重IS诱导的LVH。 2、IS通过促进NOX来源的ROS生成诱导了心肌细胞肥大,其作用与ROS下游信号p38和ERK1/2的活化有关。而Klotho蛋白能够抑制NOX表达,减弱ROS/MAPKs信号通路活性,拮抗IS诱导的心肌细胞肥大。 3、尿毒症小鼠血清中IS含量明显增高,但Klotho水平却显著降低。通过外源性补充Klotho蛋白可以显著抑制尿毒症小鼠心肌组织NOX2和NOX4的表达及ROS生成,并明显改善尿毒症小鼠的LVH。Klotho对LVH的抑制作用可能与其抗氧化应激能力密切相关。综上所述,本研究证实尿毒症毒素是诱导心肌肥大的重要因素,其机制可能与尿毒症毒素促氧化应激作用有关。而Klotho是在机体肾脏表达和分泌的抗氧化应激蛋白,可以拮抗尿毒症毒素诱导的心肌肥大。两者在尿毒症内环境下的失衡可能是LVH发生和发展的一个关键因素,而外源性补充Klotho可以显著改善尿毒症LVH。本研究不但从心、肾内在关联角度出发揭示了尿毒症心肌病的发病机理,并且以上调机体内源性物质为靶标可以为临床提供安全有效的治疗思路和治疗模式。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.5

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