二甲双胍抑制人前列腺癌细胞上皮间质转化及作用机制的研究

发布时间：2018-04-05 17:01

  本文选题：二甲双胍　切入点：上皮-间质转化　出处：《山东大学》2014年硕士论文

【摘要】：前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来,前列腺癌在我国的发病率快速增长,正日益成为严重威胁老年男性健康的疾病。目前临床治疗面临的课题之一是如何针对“侵袭性”(aggressive)前列腺癌选择高效低毒的药物,降低复发和转移的风险。二甲双胍(1,1-Dimethylbiguanide)是治疗Ⅱ型糖尿病最常用的药物之一。近年来,越来越多的证据提示,二甲双胍可以延缓部分前列腺癌患者肿瘤的生长速度并降低前列腺癌的罹患风险。但二甲双胍的抗肿瘤机制尚未完全明确。 肿瘤的侵袭和转移是前列腺癌病人死亡的重要原因。近年来的研究发现,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。最近的研究发现在乳腺癌细胞中,二甲双胍可抑制TGF-β信号通路促进的EMT过程,表现为TGFp介导的E-cadherin下调与Vimentin上调的效应消失。这一成果为后续研究提供了一定的思路和参考。由于前列腺癌和乳腺癌均为激素相关性肿瘤,我们推测二甲双胍对前列腺癌细胞EMT的发生过程亦可能发挥重要作用,但是目前尚未有相关研究报道。 本研究使用不同浓度的二甲双胍处理前列腺癌Vcap细胞,通过MTS比色法、流式细胞术分析、划痕和侵袭小室实验检测二甲双胍对Vcap细胞生物学行为的影响；采用RT-PCR和Western blot测定二甲双胍对Vcap细胞上皮指标物(E-cadherin、 β-catenin)和间质指标物(Vimentin、 N-cadherin) mRNA和蛋白表达水平的影响,阐明二甲双胍调控前列腺肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制；使用RT-PCR检测二甲双胍处理Vcap细胞后1niRNA的表达水平变化,初步阐明二甲双胍对前列腺肿瘤细胞miRNA的调控作用。 方法： 1.采用MTS法分别测定不同浓度二甲双胍(1、5、10、5Ommol/L)处理前列腺癌Vcap细胞24、48和72h后对细胞增殖的影响。 2.流式细胞仪检测5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞24h后细胞周期的分布变化。 3.划痕实验和细胞侵袭小室实验检测二甲双胍对前列腺癌Vcap细胞迁移和侵袭能力的作用。 4.RT-PCR和Vestern-blot分别检测5mmol/L二甲双胍处理24h、48h后对Vcap细胞上皮指标物(E-cadherin、 β-catenin)和间质指标物(、Vimentin、 N-cadherin)mRNA和蛋白表达水平的影响,阐明二甲双胍调控前列腺肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制。 5.运用RT-PCR检测5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞24h后对miRNA的表达水平的影响。阐明二甲双胍对Vcap细胞1niRNA的调节作用。 6.miR30a类似物和miR30a抑制物分别作用Vcap细胞24h、48h、72h后,采用MTS法检测对Vcap细胞增殖的影响。运用RT-PCR检测miR30a类似物处理Vcap细胞24h后对上皮指标物(E-cadherin)和间质指标物(Vimentin) mRNA的影响。阐明miR30a在二甲双胍调控Vcap细胞EMT中发挥的作用。 结果： 1.MTS实验结果：二甲双胍抑制前列腺癌Vcap细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性。 2.二甲双胍对Vcap细胞细胞周期分布的影响：5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞48h后,与对照组相比,G0/G1期细胞比例明显增加(54.1%vs.77.2%),而S期(13.8%vs.6.7%)和G2/M期(32.1%vs.16.1%)细胞比例均显著减少。 3.二甲双胍抑制Vcap细胞的迁移和侵袭能力：5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞48h后,划痕愈合率显著低于对照组,提示二甲双胍处理后,肿瘤细胞的迁移能力显著降低。侵袭小室实验显示5]mmol/L二甲双胍可明显抑制Vcap细胞的侵袭能力。与对照组细胞相比,5mmol/L二甲双胍抑制细胞侵袭的能力达到45%以上(P＜0.01,n=3)。 4.二甲双胍抑制Vcap细胞EMT的发生：5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞24h后,EMT相关的上皮标志物及间质标志物均发生较显著的变化。与对照组比较,二甲双胍处理组中,Vcap细胞的上皮性标志物E-cadherin和β-catenin的]mRNA表达水平明显升高,分别高于对照组6.2倍(P=0.023)、1.2倍(P=0.034)；间质性标志物Vimentin和N-cadherin的mRNA水平明显降低,分别较对照组低3.6倍(P=0.002)和2.9倍(P=0.013)。5mmol/L二甲双胍处理Vcap细胞48h后, Westernblot显示E-cadherin和β-catenin的蛋白表达水平明显升高,而Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平显著降低。5.二甲双胍对Vcap细胞]miRNA的调节作用：与对照组相比,5mmol/L二甲双胍处理24h后,可明显上调Vcap细胞中miR30a, miR143和miR196b的表达水平,其中,miR30a的变化效应最显著(呈3.5倍改变),但Vcap细胞的miR185和miR205的表达水平未有明显变化。6. miR30a对Vcap细胞增殖和EMT的影响：miR30a的类似物和抑制物分别作用Vcap细胞株24、48、72h后,与对照组相比,miR30a的类似物可明显抑制Vcap细胞的增殖,而miR30a的抑制物可明显促进Vcap细胞的增殖(P0.05)。进一步的试验发现,1niR30a的类似物作用Vcap细胞24小时后,上皮性标志物E-cadherin mRNA水平明显增高,而间质性标志物、Vimentin的mRNA水平明显降低。 结论： 1.二甲双胍明显抑制前列腺癌Vcap细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性。 2.二甲双胍阻滞前列腺癌Vcap细胞进入S期,使其停留在G0/G1期。 3.二甲双胍抑制前列腺癌Vcap细胞的迁移和侵袭能力。 4.二甲双胍抑制前列腺癌Vcap上皮间质转化的过程,该过程可能与二甲双胍上调miR30a表达有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

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本文编号：1715658