MDM2在高糖诱导的足细胞有丝分裂灾难中的作用及机制
本文选题：MDM2 切入点：有丝分裂灾难 出处：《华中科技大学》2016年博士论文
【摘要】：足细胞损伤和丢失是糖尿病肾病(DN)发病机制的关键环节,然而高糖诱导足细胞损伤和丢失的具体机制尚未完全阐明。研究表明,作为终末分化细胞,足细胞一旦重新进入细胞周期发生有丝分裂将走向死亡一即有丝分裂灾难。MDM2是一种E3泛素连接酶,可通过多种信号通路调控细胞周期和有丝分裂。既往研究发现MDM2在肾小管及肾小球足细胞有表达,但其在肾脏疾病相关的细胞周期及有丝分裂异常中的作用尚未见报道。本研究采用临床DN患者肾活检标本、DN小鼠模型和条件永生化足细胞为研究对象,研究足细胞有丝分裂灾难在DN进程中的病理生理意义并探讨MDM2在足细胞有丝分裂灾难发生中的关键作用,以期为DN的早期防治提供新的理论依据。第一部分MIDM2参与诱导高糖环境下足细胞有丝分裂灾难目的：(1)观察MDM2在DN患者、DN模型小鼠肾小球及高糖环境下足细胞的表达情况;(2)观察体内及体外高糖环境中足细胞有丝分裂情况并探究MDM2在其中所起的作用。方法：(1)通过单次腹腔注射STZ建立DN小鼠模型;(2)利用共聚焦显微镜及免疫荧光双标法检测MDM2表达水平与DN小鼠足细胞标志分子Synaptopodin的共定位情况；(3)通过透射电镜观察DN患者足细胞超微结构；(4)通过慢病毒转染敲低MDM2在体外人足细胞的表达；(5)采用Western blot方法检测MDM2及有丝分裂标志分子Aurora B和p-H3-ser10蛋白在高糖环境下足细胞的表达,以及敲低MDM2后有丝分裂标志分子的表达变化；(6)通过流式细胞术检测高糖以及MDM2敲低对足细胞细胞周期的影响；(7)使用鬼笔环肽染色F-actin及LDH细胞毒性活性检测试剂盒检测高糖环境下体外培养人足细胞的损伤以及敲低MDM2后对足细胞损伤的影响。结果：(1)DN患者和STZ诱导的DN模型小鼠肾小球中MDM2表达水平升高,且MDM2与DN小鼠足细胞标记蛋白synaptopodin共定位增加：(3)DN患者肾活检标本中,存在发生异常有丝分裂的足细胞,且在体外高糖环境下增殖细胞标志Ki67、有丝分裂标志分子Aurora B和p-H3-ser10表达上调,S期和G2/M期细胞增多,说明体外足细胞在高糖刺激下重新进入细胞周期并发生有丝分裂；(3)在体外高糖环境下足细胞MDM2表达增多,敲低MDM2可减轻高糖所致的Ki67、Aurora B和p-H3-ser10表达上调,并可减轻高糖所致的G2/M期细胞比例增加;(4)在体外培养足细胞中敲低MDM2可部分逆转高糖所致的足细胞F-actin排列异常及LDH释放增多,从而减轻足细胞损伤。结论：(1)DN小鼠和体外高糖环境下的人足细胞中存在足细胞有丝分裂异常并伴随MDM2表达增加；(2)敲低MDM2可抑制高糖诱导的足细胞有丝分裂灾难从而减轻足细胞损伤。第二部分高糖环境下MDM2参与介导足细胞有丝分裂灾难的可能机制目的：(1)探究高糖环境下MDM2是否通过p53依赖途径介导足细胞有丝分裂灾难：(2)探究高糖环境下MDM2是否通过非p53依赖途径介导足细胞有丝分裂灾难。方法：(1)通过Western blot方法检测nutlin3a对足细胞p53的表达水平及高糖诱导的足细胞损伤标志分子Desmin表达上调的影响,从而判断p53是否是介导MDM2诱导的足细胞有丝分裂灾难的下游因子;(2)通过免疫荧光及Western blot方法观察Numb和NICD在DN小鼠肾小球中的表达情况；(3)检测Numb.NICD及其下游分子Hes1在高糖环境下足细胞的表达情况,以及敲低MDM2后Numb、 NICD以及其下游分子Hes1的表达变化；(4)通过siRNA敲低足细胞中NICD的表达,并采用Western blot方法检测有丝分裂标志分子Aurora B和p-H3-ser10蛋白的表达,以判断NICD是否是介导MDM2诱导的足细胞有丝分裂灾难的下游因子。结果：(1)在体外,nutlin3a干预可影响足细胞P53及MDM2的表达,但对高糖诱导的足细胞损伤无明显影响;(2)STZ诱导的1型糖尿病肾病模型小鼠肾小球中Numb表达水平降低,而DN小鼠肾皮质NICD表达水平升高；(3)在体外人足细胞中敲低MDM2基因表达可引起Numb、NICD及其下游分子Hes1的表达变化;(4)在体外永生化足细胞中敲低NICD基因表达可减轻足细胞有丝分裂灾难。结论：(1)MDM2通过非p53途径介导高糖诱导的足细胞有丝分裂灾难：(2)高糖环境下足细胞中Numb-Notch1是MDM2的下游通路,MDM2可能通过此通路介导高糖诱导的足细胞有丝分裂灾难。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
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，本文编号：1721714
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