MicroRNA-195下调BCOX1在前列腺癌中的表达后抑制前列腺肿瘤增殖和转移的实验研究

发布时间：2018-04-08 13:40

本文选题：miRNA　切入点：miR-195　出处：《武汉大学》2015年博士论文

【摘要】：目的：前列腺癌(prostate cancer,PCa)在欧美地区等发达国家是最常见的恶性肿瘤,在男性恶性肿瘤中死亡率较高,死亡率仅次于支气管肺癌。虽然前列腺癌在早期诊断和治疗方法上有了很大的进展,由于复发和转移,部分前列腺癌患者的疗效仍不令人满意。前列腺癌在初始治疗时大多为激素依赖性肿瘤,内分泌治疗后易转变为激素非依赖性。难治性前列腺癌患者最终随着疾病的进展而死亡。前列腺癌肿瘤的发生、发展和复发转移牵涉到多种信号通路和不同的分子机制。常由多种原癌基因和抑癌基因参与,是一个非常复杂的过程。所以寻找前列腺肿瘤早期诊断的标志物和新的治疗靶点成为泌尿外科研究的重要课题。近年来大量的研究证明miRNA与肿瘤的发生发展中起着极其重要的作用,miRNA家族在转录后水平有极强的调节能力。越来越多的科学家参与到miRNA的研究中。超过50%的已知miRNA通过直接调控分子靶点参与肿瘤的发生和转移。到目前为止,与前列腺癌疾病相关的大部分miRNA还不清楚。已有研究表明miR-195在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。在不同的肿瘤组织中,miR-195的表达方式具有差异性。进一步研究表明miR-195在多种肿瘤中具有抗肿瘤增殖和转移的作用。miR-195通过作多种肿瘤治疗的分子靶点,参与肿瘤的生长、增殖、凋亡、侵袭与迁移的调节。以上研究结果表明miR-195在肿瘤的临床诊断、治疗、预后有着巨大的应用前景,还可以应用到改善肿瘤的耐药性。到目前为止miR-195在前列腺癌中的表达调控情况和与前列腺癌的相关性尚未进行研究。本实验将在前列腺癌中进行miR-195的相关研究,了解miR-195在前列腺癌中的表达与功能以及调控机制。前列腺肿瘤发生、发展和转移的分子机制随着新的miRNA的发现有了进一步的认识,可能为临床分子靶向治疗提供新的作用靶点。方法：将采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对不同前列腺癌组织中miR-195的mRNA表达情况及与前列腺癌临床关系进行分析研究。完整收集患者年龄、术前血清PSA、前列腺癌临床分期,记录患者术后前列腺癌Gleason评分。对切缘情况、淋巴结转移、精囊浸润、血管浸润、神经周围浸润的情况做完整记录。术后定期随访记录PSA生化复发情况。将miR-195在前列腺癌中的表达情况用统计学方法与各个临床病理学参数进行相关性分析。我们将miR-195表达载体转染入前列腺癌细胞系(PC-3和LNCaP)中,研究miR-195对前列腺癌细胞的调控作用。对不同处理组前列腺癌细胞进行细胞集落实验方法、transwell迁移实验和transwell侵袭实验。从而检测miR-195对前列腺癌细胞的增殖能力、前列腺癌细胞迁移能力和前列腺癌细胞侵袭能力的影响。通过上调细胞中miR-195的表达,观察miR-195对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的功能影响。进一步通过生物信息学预测软件推测BCOX1为miR-195的靶基因。利用microarray数据库中大量已知检测结果,应用统计学方法将不同前列腺癌临床病理学参数和BCOX1表达水平进行分析。发现BCOX1的表达水平与前列腺癌患者参数有一定相关性,可能为前列腺癌肿瘤相关基因。双荧光素酶报告基因实验确定miR-195与BCOX1之间的直接调控关系。在上调miR-195表达的前列腺癌细胞中利用qRT-PCR和western blot检测BCOX1的mRNA和蛋白表达水平的改变；在前列腺癌组织中分析BCOX1的mRNA表达水平和miR-195之间的关系,从而进一步检验miR-195可以负向调控BCOX1的表达。在体外实验中研究miR-195通过负向调控BCOX1对前列腺癌细胞的生物学影响。在PC-3和LNCaP前列癌细胞中分别构建四组细胞：miR-195高表达组,shRNA抑制BCOX1组,miR-195+BCOXl共表达组合和对照组来研究前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。从而研究miR-195在前列腺癌细胞中的调控作用。在体内实验中,利用PC-3和LNCaP前列癌细胞中分别构建的三组细胞：miR-195高表达组,miR-195+BCOX1共表达组合和对照组在裸鼠移植瘤实验。记录不同组前列腺癌细胞移植瘤生长情况,研究miRNA-195和BCOX1在裸鼠移植瘤内表达水平变化。进一步评估miRNA-195基因对裸鼠前列腺癌移植瘤生长曲线的影响,最后在体内实验水平上证实miRNA-195能够通过沉默BCOX1的表达抑制裸鼠体内移植瘤生长和转移。结果：实验的结果表明miR-195在前列腺癌组织中低表达。miR-195与血PSA、Gleason评分、临床分期和精囊侵犯密切相关。miR-195对于前列腺癌患者PSA生化复发和患者的总生存具有有效的预测参考作用。成功的建立了高表达miR-195的PC-3和LNCaP细胞系。上调细胞中miR-195的表达,可以降低前列腺细胞的克隆形成能力和迁移与侵袭能力。通过miRNA靶基因的生物信息学预测软件推测miR-195可作用于BCOX1的3'UTR。双荧光素酶报告基因实验进一步确定miR-195与BCOX1之间的直接调控关系。miRNA-195可以通过沉默BCOX1基因的表达,来调节前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学行为的功能。体内实验水平验证miR-195对PC-3和LNCaP细胞的抑瘤作用。结论：miR-195在前列腺癌细胞中可以通过直接特异性结合于BCOX1的3'UTR区,负向调控BCOX1的表达。miR-195在体外实验中通过沉默BCOX1抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。miR-195在体内实验中通过沉默BCOX1对移植瘤的生长和转移起到了非常有效的抑制作用。对miR-195及其作用靶点BCOX1的研究有助于进一步认识前列腺肿瘤发生、发展、转移和复发的分子机制,为临床分子靶向治疗的研究提供了新的作用靶点。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25

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