睾丸组织高表达基因fancd2os的细胞特异性分析及初步功能研究

发布时间：2018-04-09 04:04

  本文选题：fancd2os　切入点：精子发生　出处：《山西医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究目的:在课题组前期研究的基础上,利用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印迹技术(Western blotting)从mRNA和蛋白水平分析fancd2os基因在睾丸组织不同细胞系中的表达谱;通过免疫组织化学和免疫荧光染色分析FANCD2OS蛋白在睾丸组织中的细胞定位;并进一步建立过表达fancd2os基因的HEK293T细胞模型,从细胞水平深入探讨fancd2os基因的潜在功能。研究方法:1.通过实时定量PCR分析fancd2os mRNA在精原细胞(GC1-spg)、精母细胞(GC2-spd)、睾丸Leydig间质细胞(TM3)、睾丸Sertoli支持细胞(TM4)四种细胞系中的表达;2.运用Western blotting方法检测FANCD2OS蛋白在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四种细胞系的表达;3.利用免疫组织化学和免疫荧光染色分析FANCD2OS蛋白在睾丸组织中的细胞定位;4.建立fancd2os基因过表达的HEK293T细胞模型,分别利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blotting检测fancd2os基因的过表达情况;5.采用CCK8方法检测过表达fancd2os基因对HEK293T细胞增殖能力的影响;6.利用Western blotting检测过表达fancd2os基因后HEK293T细胞Caspase3蛋白的水平;7.运用Caspase3荧光染色试剂盒对紫外诱导后HEK293T细胞凋亡状况进行分析;8.运用流式细胞术检测过表达fancd2os基因对紫外诱导HEK293T细胞凋亡、线粒体膜电位水平的影响。研究结果:1.实时定量PCR结果显示fancd2os mRNA在四种细胞系中均有表达,但是在TM3中的表达水平相对较高;2.Western blotting结果显示FANCD2OS蛋白在四种细胞中都有表达,在TM3中的表达水平相对较高;3.免疫组织化学和免疫荧光染色均发现FANCD2OS蛋白主要定位在睾丸间质细胞中;4.RT-PCR和Western blotting分析显示在HEK293T细胞模型中检测到fancd2os基因的过表达;5.CCK8结果表明转染重组质粒的HEK293T细胞增殖能力明显高于空载体组和裸细胞组(p0.05);6.Western blotting结果显示过表达组活化型Caspase3含量明显高于其余两组;7.荧光染色实验发现转染组的Caspase3荧光阳性信号明显多于空载体组和对照组;8.流式细胞术分析表明过表达组的细胞凋亡程度明显高于空载体组和裸细胞组(p0.01),线粒体膜电位下降的百分比明显高于空载体组和裸细胞组(p0.05)。研究结论:1.fancd2os基因在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四种细胞系中均有表达,但在TM3中的相对表达水平较高;2.fancd2os基因过表达可以抑制HEK293T细胞的增殖能力,降低线粒体膜电位,使细胞内激活型Caspase3蛋白水平增高,对细胞凋亡具有促进作用。
[Abstract]:Objective: to analyze the expression profiles of fancd2os gene in different cell lines of testicular tissue from mRNA and protein level using real-time quantitative PCR(Real-time PCR and Western blotting.The localization of FANCD2OS protein in testicular tissue was analyzed by immunohistochemistry and immunofluorescence staining, and the HEK293T cell model of overexpression of fancd2os gene was established to explore the potential function of fancd2os gene from the cellular level.Research method: 1.The expression of fancd2os mRNA was analyzed by real-time quantitative PCR in four kinds of cell lines: spermatogonia GC1-spg, spermatocyte GC2-spdg, testicular Leydig stromal cell TM-3, testicular Sertoli Sertoli cell line TM4).Western blotting method was used to detect the expression of FANCD2OS protein in four cell lines of GC1-spgC2-spdf3 and TM4.Immunohistochemistry and immunofluorescence staining were used to analyze the cellular localization of FANCD2OS protein in testis.A HEK293T cell model of overexpression of fancd2os gene was established. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were used to detect the overexpression of fancd2os gene.The effect of overexpression of fancd2os gene on the proliferation of HEK293T cells was detected by CCK8 assay.The level of Caspase3 protein in HEK293T cells after overexpression of fancd2os gene was detected by Western blotting.Caspase3 fluorescent staining kit was used to analyze the apoptosis of HEK293T cells induced by UV.The effects of overexpression of fancd2os gene on ultraviolet-induced apoptosis and mitochondrial membrane potential in HEK293T cells were detected by flow cytometry.The result of the study was: 1.The results of real-time quantitative PCR showed that fancd2os mRNA was expressed in all four cell lines, but the expression level in TM3 was relatively high. 2. Western blotting analysis showed that FANCD2OS protein was expressed in all of the four cell lines, and the expression level in TM3 was higher than that in TM3.Immunohistochemistry and immunofluorescence staining showed that FANCD2OS protein was mainly located in the interstitial cells of testis. 4. RT-PCR and Western blotting analysis showed that the overexpression of fancd2os gene was detected in HEK293T cell model.The cell proliferation ability was significantly higher than that of empty vector group and bare cell group. 6. The results of Western blotting showed that the content of activated Caspase3 in overexpression group was significantly higher than that in the other two groups.Fluorescence staining showed that the Caspase3 positive signal in transfection group was significantly higher than that in empty vector group and control group.Flow cytometry analysis showed that the degree of apoptosis in overexpression group was significantly higher than that in empty vector group and bare cell group, and the percentage of decrease in mitochondrial membrane potential was significantly higher than that in empty vector group and bare cell group.Conclusion: 1. Fancd2os gene was expressed in four cell lines of GC1-spgC2-spdtit TM3TM4. However, the overexpression of Fancd2os gene in TM3 could inhibit the proliferation of HEK293T cells, decrease mitochondrial membrane potential, and increase the level of intracellular activated Caspase3 protein.It can promote apoptosis.
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2;Q78

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本文编号：1724744