解脲脲原体Ferritin蛋白和MsrA蛋白抗氧化功能及其机制研究

发布时间：2018-04-11 12:12

本文选题：解脲脲原体 + 活性氧物质　；参考：《南华大学》2015年博士论文

【摘要】：背景与目的:解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)是能在体外培养的最小的原核细胞型微生物之一。Uu是人类泌尿生殖道一种常见的病原体,除了与尿道炎、前列腺炎、风湿性关节炎和盆腔炎等疾病密切相关外,Uu感染还可导致精子尾部缺陷、活动力下降及精子内活性氧上升,从而可能导致男性不育。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是生物机体正常有氧代谢中不可避免的副产物,人巨噬细胞能够利用ROS以杀伤入侵的病原菌。为了能够在机体内存活,病原菌在进化过程中形成了多种机制来抵抗ROS引起的损伤。Uu在定植过程中不可避免会遭遇过氧化伤害,因此,抗氧化能力对于Uu的存活及其致病性至关重要。迄今为止,Uu的抗氧化作用机制仍不清楚。本文旨在通过研究Uu铁蛋白(Ferritin)和蛋氨酸亚砜还原酶(Msr A)的抗氧化功能及其作用机制,为阐明Uu的抗氧化作用机理提供实验依据。方法:1.按照200∶1的比例将Uu与THP-1细胞分别共孵育3h、6h、12h和24h,取细胞培养上清,加入DCFH-DA以测定ROS含量。2.利用生物信息学方法分析Uu的Ferritin和Msr A的编码基因。3.分别用H2O2、异丙苯基过氧化氢(Cumene hydroperoxide,CHP)和叔丁基氢过氧化物(t-BHP)胁迫Uu 20min、40min和60min,荧光定量PCR测定胁迫条件下Ferritin和Msr A基因的表达情况。4.PCR扩增Ferritin和Msr A基因片段,将其分别连接到表达载体p ET28a以获得重组载体p ET28a-Ferritin和p ET28a-Msr A,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的蛋白表达,并经Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。5.利用固相亲和层析法和内源荧光法测定Ferritin蛋白和Fe2+的结合情况;用分光光度法测定Ferritin蛋白的促铁氧化动力学曲线;并用体外实验测定Ferritin蛋白的抗氧化能力;用凝胶阻滞法检测Ferritin蛋白与DNA的结合能力及其保护DNA的功能。6.将Ferritin基因连接到表达载体p Trc99a构建p Trc99a-Ferritin重组载体,将其转化入氧化敏感型大肠杆菌突变株(Δdps,JW0797-1),分别测定重组菌和对照菌在氧化胁迫下的存活率。7.分光光度法测定重组Uu Msr A蛋白将Met-O还原为Met的功能。8.将Msr A基因连接到p Trc99a以获得p Trc99a-Msr A重组载体,将其转化入大肠杆菌突变体(ΔMsr A,JW4178-3),测定该重组菌和对照菌在不同氧化胁迫下的存活率。结果:1.Uu感染能够诱导THP-1细胞产生ROS。2.经生物信息学软件分析,发现Uu基因组中含有一个Ferritin和Msr A基因。3.Ferritin基因在H2O2胁迫20、40或60min后,Ferritin基因的表达量分别上调了3.5倍、4.4倍和5.1倍;在经过CHP胁迫20、40或60min后,Ferritin基因的表达量都上调了4倍;在经t-BHP胁迫20、40或60min后,基因表达量则分别上调了2.4倍、3.2倍和3.1倍。Uu Msr A基因在H2O2胁迫20、40或者60min时,Msr A基因的表达量分别上调了4.5倍、6倍和6倍;在经CHP胁迫20、40或者60min时,其表达量都上调了11倍,而在经t-BHP胁迫时则分别上调了3倍、3.5倍和4倍。4.成功构建了重组表达载体p ET28a-Ferritin和p ET28a-Msr A,用IPTG分别诱导含有重组载体的重组菌表达了分子量约为22k Da的重组Ferritin蛋白和分子量约为21k Da的重组Msr A蛋白,经亲和层析后获得了纯化的重组Ferritin蛋白和Msr A蛋白。5.Ferritin蛋白能够结合Fe2+离子,Fe2+离子能使Ferritin蛋白的内源性荧光强度降低;重组Uu Ferritin蛋白具有亚铁氧化酶功能,可将Fe2+氧化成Fe3+;Ferritin蛋白具有抗氧化功能,其IC50值明显低于BSA蛋白的IC50值(p0.05)。H2O2和Fe2+可以诱导Ferritin蛋白与DNA结合,并且Ferritin蛋白能够阻止DNA受到氧化损伤。6.与对照组(转化p Trc99a空载体)相比,转化p Trc99a-Ferritin突变株的大肠杆菌对氧化应激表现为高耐受性(p0.05)。7.Msr A蛋白具有将Met O还原为Met的能力。8.转化了Msr A基因的ΔMsr A大肠杆菌突变体获得了氧化应激耐受力。结论:1.氧化应激能够上调Uu Ferritin基因的表达;Uu Ferritin蛋白具有Fe2+结合特性及亚铁氧化活性;Fe2+和H2O2能够诱导Ferritin与DNA发生结合,并且能够保护DNA免受氧化损伤;Uu Ferritin蛋白在细胞外和细胞内都具有抗氧化能力,Ferritin蛋白在Uu的抗氧化胁迫中发挥重要作用。2.氧化应激能够上调Uu Msr A基因的表达;Msr A蛋白能够将氧化型Met(L-Met O)还原为Met;Msr A蛋白的表达能够提高氧化敏感型E.coli(ΔMsr A)的抗氧化胁迫能力;当Uu处于氧化胁迫时,Msr A蛋白能够修复氧化损伤的蛋白质,因而发挥抵抗氧化应激的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R691.3

【参考文献】