还原型β2糖蛋白Ⅰ抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞VEGF-NO轴解偶联的机制

发布时间：2018-04-15 06:38

  本文选题：糖尿病肾病 + 内皮源性一氧化氮合酶　； 参考：《天津医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一,亦是导致终末期肾功能衰竭的重要原因。我国DN的患病率呈快速增长的趋势,DN已成为糖尿病患者致死的主要原因之一。DN的发病机制复杂,近来研究发现VEGF-NO轴解耦联是DN的致病机制之一。我们前期研究证实还原型β2糖蛋白I(reducedβ2-Glycoprotein I,r-β2GPI)可调节VEGF信号通路,抑制糖尿病视网膜病变新生血管形成,此外r-β2GPI可抑制TGF-β1-p38 MAPK信号途径减轻糖尿病小鼠肾病的程度及抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞IV型胶原的表达。本研究以大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1为研究对象,旨在探讨:1.β2GPI及r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞VEGF-NO轴功能的影响;2.β2GPI及r-β2GPI影响高糖条件下HBZY-1细胞VEGF-NO轴功能的机制。方法:1.培养HBZY-1细胞。实验共分为6组:①正常对照组(NC组):5.5m M葡萄糖;②高渗对照组(MC组):5.5m M葡萄糖+19.5m M甘露醇;③高糖组(HG组):25m M葡萄糖;④高糖+HSA对照组(HSA组):25m M葡萄糖+100μg/ml HSA;⑤高糖+β2GPI干预组(β2GPI组):25m M葡萄糖+100μg/mlβ2GPI;⑥高糖+r-β2GPI干预组(r-β2GPI组):25m M葡萄糖+100μg/ml r-β2GPI。2.NO测试盒测定β2GPI和r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞分泌NO的影响;采用ROS荧光探针DCFH-DA,通过荧光显微镜定性观察及流式细胞仪定量检测β2GPI和r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞生成ROS的影响。3.q RT-PCR法检测β2GPI和r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞VEGF-NO轴相关蛋白VEGF、VEGFR-2、e NOS、GCH-1 m RNA表达的影响。4.Western Blot法观察β2GPI和r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞VEGF-NO轴关键蛋白e NOS活性的影响及对VEGF受体后信号转导通路中Akt磷酸化水平的影响。结果:1.高糖可明显抑制HBZY-1细胞NO的生成达33%(P0.05),β2GPI及r-β2GPI可拮抗高糖引起的NO表达减少,促进NO的生成(P0.05),且r-β2GPI的作用强于β2GPI,分别是HG组的2.10倍、1.88倍(P0.05)。2.与正常对照组相比,高渗及高糖均促进HBZY-1细胞ROS的生成(P0.05),高糖条件下HG组及HSA组两组间ROS平均荧光强度无统计学差异(P0.05),均明显高于NC组和MC组(P0.05),β2GPI及r-β2GPI可抑制高糖条件下HBZY-1细胞ROS的生成,降低ROS水平(P0.05),且r-β2GPI的作用强于β2GPI(P0.05)。3.高糖可促进HBZY-1细胞VEGF、VEGFR-2 m RNA的表达(P0.05),抑制GCH-1 m RNA的表达(P0.05),但对e NOS m RNA的表达无明显影响(P0.05)。β2GPI及r-β2GPI对高糖条件下HBZY-1细胞VEGF的表达无明显影响(P0.05),可降低高糖条件下VEGFR-2 m RNA的表达水平(P0.05),增加高糖条件下GCH-1、e NOS m RNA的表达。β2GPI组和r-β2GPI组两组间VEGF、VEGFR-2、GCH-1、e NOS m RNA的表达水平均无统计学差异(P0.05)。4.高糖抑制HBZY-1细胞e NOS Ser1177的磷酸化(P0.05),β2GPI及r-β2GPI可提高高糖条件下e NOS Ser1177的磷酸化水平(P0.05),两者之间无统计学差异(P0.05)。5.高糖抑制HBZY-1细胞Akt的磷酸化(P0.05),β2GPI及r-β2GPI可促进高糖条件下Akt的磷酸化(P0.05),两者之间的作用无统计学差异(P0.05)。结论:1.高糖环境下HBZY-1细胞VEGF、VEGFR-2 m RNA水平升高,GCH-1m RNA表达减少,e NOS m RNA表达无明显改变,但e NOS磷酸化水平明显降低,致NO分泌减少且ROS生成增加,即存在高糖诱导下的系膜细胞VEGF-NO轴解偶联。2.β2GPI及r-β2GPI均可拮抗高糖环境下HBZY-1细胞NO分泌减少和ROS生成增多,促进GCH-1 m RNA的表达,降低VEGFR-2 m RNA的表达水平,促进Akt磷酸化,提高e NOS的磷酸化水平。可能机制为β2GPI及r-β2GPI通过调节VEGFR-2的表达及VEGF受体后信号通路中的关键蛋白Akt的磷酸化水平,激活e NOS,增加NO分泌,减轻氧化应激水平,对高糖环境下的系膜细胞起保护作用。3.与β2GPI相比,r-β2GPI促进HBZY-1细胞NO分泌、抑制ROS生成的作用更强。可能是由于r-β2GPI包含有游离巯基,空间构象及表面所带电荷发生改变,使其功能发生改变且具有更强的抗氧化能力,但两者均通过调节VEGF受体及受体后信号通路发挥作用。
[Abstract]:Objective: diabetic nephropathy (diabetic nephropathy DN) is one of the chronic complications of diabetes and the most common and most serious, also is an important cause of end-stage renal failure. The prevalence of DN in China shows the trend of rapid growth, DN has become one of the main reasons for the pathogenesis of death in diabetic patients.DN complex, recent research VEGF-NO axis uncoupling is one of the pathogenic mechanism of DN. Our previous studies demonstrated reduced beta 2 glycoprotein I (reduced 2-Glycoprotein I r- beta, beta 2GPI) can regulate VEGF signaling pathway, inhibition of angiogenesis in diabetic retinopathy, the expression of r- in beta 2GPI can inhibit the TGF- 1-p38 beta MAPK signaling pathway to reduce nephropathy in diabetic mice the degree of inhibition and high glucose induced glomerular mesangial cells of type IV collagen. In this study, the rat mesangial cell line HBZY-1 as the research object, aims to explore: 1. beta 2GPI and r- beta 2GP I瀵归珮绯栨潯浠朵笅HBZY-1缁嗚優VEGF-NO杞村姛鑳界殑褰卞搷;2.尾2GPI鍙妑-尾2GPI褰卞搷楂樼硸鏉′欢涓婬BZY-1缁嗚優VEGF-NO杞村姛鑳界殑鏈哄埗.鏂规硶:1.鍩瑰吇HBZY-1缁嗚優.瀹為獙鍏卞垎涓，

本文编号：1752991