miR-503在前列腺癌的抑癌作用及其机制研究

发布时间：2018-04-17 20:36

本文选题：微小RNA + 前列腺癌　；参考：《浙江大学》2014年博士论文

【摘要】：背景：前列腺癌在目前男性肿瘤发病率里居第二位,据统计,美国在2012年新发病例241740例,死亡病例28170例。我国近年来随着PSA筛查的开展,其发病率也逐年上升。根据目前人们对前列腺癌的发病原因和进展机制研究发现,除了常见的遗传学因素,许多重要的分子事件是导致肿瘤细胞形成、进展和转移的深层次原因。关于RNA的研究近年来受到了广泛的关注,甚至被评为“十大科技突破之一”,而其中最引人注意的是microRNA (miRNA)。miRNA是一类小分子非编码RNA,作为一种重要的基因调控物质,调控大约30%人类基因的转录,控制着细胞的分化、增殖和程序性细胞死亡等多种重要生理过程。大量证据表明,超过50%的人类miRNA基因与癌症有关,其在多个不同类型的肿瘤及疾病中异常表达,且与肿瘤发生、发展密切相关。目的：本研究首先通过测定miR-503在前列腺癌PC-3及DU-145细胞株中的表达情况,并通过一系列功能实验研究了miR-503在前列腺癌细胞中的生物学功能,然后根据生物信息学知识,对miR-503潜在的靶点进行预测并加以验证,并通过靶点分子的沉默和过表达实验,证实miR-503对靶点的调控意义。方法：1.检测前列腺癌细胞株中miR-503的表达量,并与前列腺正常上皮细胞株中miR-503的表达量进行比较；并检测CCND1在前列腺癌细胞及组织芯片中的表达情况,检测TLN1在前列腺癌细胞中的表达情况,证明CCND1及TLN1在前列腺癌细胞与正常细胞之间存在差异表达； 2.通过体外转染miR-503mimic的方式使细胞呈现miR-503过表达趋势以此进行获得性功能实验。在此基础上,通过细胞活力分析实验(CCK-8)、平板克隆形成、流式细胞术以及Transwell实验,研究miR-503与的哪些细胞功能有关； 3.使用在线生物信息学工具,预测并挑选潜在的miR-503靶基因,并通过构建荧光素酶报告系统对这些靶点进行验证,并利用Western Blot、RNA干扰和质粒过表达等实验进一步证实靶向调控关系。结果：1.与前列腺正常上皮细胞株RWPE-1相比,在前列腺癌PC-3和DU-145细胞株中,miR-503均呈低表达,而CCND1及TLN1呈高表达。在组织芯片中,CCND1在癌组织较癌旁组织呈高表达； 2.通过对PC-3和DU-145细胞转染miR-503mimic来过表达细胞中的miR-503,我们观察到细胞的存活率明显受到抑制,用50nM的mimic处理后,PC-3在处理48小时及72小时后抑制率分别达到了26%和36%(p0.05),而DU-145的抑制率在处理48小时及72小时后分别达到29%和38%(p0.05)。平板克隆形成实验显示,miR-503过表达使PC-3细胞克隆形成率下降了36%,使DU-145细胞克隆形成率下降了19%。流式细胞周期检测发现miR-503mimic处理可以诱导PC-3和DU-145细胞发生G1期阻滞,50nM miR-503mimic作用48小时后,PC-3和DU-145细胞G1期的比例分别增加13%和12%,而流式细胞凋亡检测提示miR-503过表达并不能诱导细胞凋亡。此外,Transwell小室实验则提示miR-503能显著地影响细胞的侵袭和迁移行为。 3.根据生物信息学知识,我们预测miR-503的可能靶基因为CCND1、TLN1。荧光素酶双报告系统和western实验证实CCND1是miR-503与周期相关的直接作用靶点,而TLN1是与侵袭迁移功能相关的直接作用靶点。对CCND1实施特异性沉默和过表达进一步证实了其在miR-503调控细胞周期过程中的作用；对TLN1实施特异性沉默进一步验证了其在miR-503调控细胞侵袭迁移功能中的作用。结论：1.miR-503在前列腺癌细胞中呈低表达,而CCND1、TLN1则呈高表达。 2.过表达miR-503使得前列腺癌细胞PC-3和DU-145发生细胞周期阻滞及增殖显著抑制,并削弱了细胞的克隆形成能力。同时,还抑制了细胞的侵袭及迁移功能。 3. CCND7、TLN1是miR-503的靶基因。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】