TGF-β1诱导的上皮—间质转化在人膀胱尿路上皮癌中的研究
发布时间：2018-04-21 10:58
本文选题：TGF-β1 + 上皮-间质转化 ； 参考：《中南大学》2014年博士论文
【摘要】：第一部分构建经TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮细胞癌T24细胞并验证 目的探索利用TGF-β1因子提高人膀胱尿路上皮癌T24细胞系EMT水平的最佳诱导浓度和诱导时间,并进行基因表达、生物学行为等的验证。 方法培养人膀胱尿路上皮癌T24细胞系并传代,使用不同浓度的TGF-β1因子进行诱导,然后在不同时间点对细胞形态变化进行观察。利用实时荧光定量PCR技术对上皮细胞-间质转化的标志物(如：Vimentin、MMP2、E-cadherin、slug、ZEB1等等)的表达水平进行检测。利用细胞划痕试验、Transwell小室迁移试验等对诱导前后细胞的侵袭、穿透、迁移等能力进行检测和评估,进一步验证TGF-β1因子在T24细胞EMT进程中的最佳诱导浓度和诱导时间。 结果浓度为lOng/ml的TGF-β1诱导T24细胞36h后,T24细胞的细胞形态变化提示有上皮细胞间质化发生；同时,EMT标志基因的表达水平亦出现相应改变,如：间质细胞标志物Vimentin和MMP2表达水平上调,E-cadherin等上皮细胞标志物表达下调,slug、 ZEB1等促EMT因子表达上调；另外,细胞划痕试验显示,lOng/ml的TGF-β1因子诱导前后两组的平均愈合面积(百分比)差异有显著性(0.81vs1,P0.05)；同样,Transwell小室迁移试验检测T24-N.C.组和T24-TGF-β1组细胞的侵袭情况发现10ng/mlT24-TGF-β1组细胞侵袭能力明显增强,(每视野平均细胞数54.6vs97.65,P0.05)。 结论膀胱尿路上皮癌T24细胞经浓度为10ng/ml的TGF-β1因子诱导36小时后其细胞形态学呈现较为明显的上皮细胞间质化改变。并且其诱导后细胞的基因呈现EMT化的相关表达,其细胞的侵袭、穿透、远处迁移等能力均有明显增强。 第二部分构建TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24细胞的mRNA和microRNA的表达谱 目的构建TGF-β1因子诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞的microRNA表达谱和mRNA的表达谱。 方法对TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24细胞的总RNA进行提取,并予以质检。质检合格后进行RNA纯化、孵育加尾、标记生物素荧光、芯片杂交、清洗染色、扫描芯片、数据提取以及数据标准化等,所用芯片为目前较为先进GeneChip(?)PrimeView M Human Gene Expression Array芯片以及Multispecies miRNA2.0array芯片。然后注册并利用分子功能注释3.0系统(Capital Bio(?) Molecule Annotation System V3.0, MAS3.0)对芯片结果进行相关分析(如GO, KEGG pathway,靶基因预测,列联分析等等)。 结果经10ng/ml TGF-β1因子诱导36小时后的膀胱尿路上皮癌T24细胞共有包括SPC25等在内的1062个基因的表达下调,以及包括ASNS基因在内的572个基因的表达上调。经KEGG pathway平台分析发现,共有包括Cell cycle等在内的40条信号传导通路与之密切相关。利用GO数据库对该基因集进行阐释,共运算出1250条相关的GO信息,其中多与细胞周期、细胞分裂、黏附、代谢调控、免疫反应、运动等密切相关。microRNA芯片扫描结果则显示,microRNA-1184等在内的6个转录本表达下调,而以及包括microRNA-21等在内的8个microRNA的表达上调。MicroRNA芯片与mRNA芯片列联分析发现包括microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638在内的3个microRNAs与部分差异表达的基因的表达趋势存在相关,其中包括ACVR1C、NOG、THBS1、TUBB2A等基因与EMT过程相关性较高。 结论获得了TGF-β1诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞系EMT过程中的mRNA以及microRNA的差异表达谱；T24细胞系EMT进程中涉及到包括Cell cycle等在内的多个分子信号通路,这些分子信号通路多与细胞的生长、连接、黏附、运动、侵袭等生物学行为相关；microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638很可能通过靶向调控ACVR1C等基因的方式在T24细胞的EMT进程中发挥作用。 第三部分对TGF-β1因子诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞的生物芯片分析结果的验证 目的对生物信息学分析的基因芯片及microRNA芯片的结果进行初步的实验室验证,以期提高该分析结果的可信性。 方法利用microRNA mimics以及microRNA inhibitor对microRNA进行过表达以及抑制表达。Real-time PCR试验验证三个microRNA的表达趋势是否与芯片结果相同、mimics和inhibitor的表达效果、以及对靶基因表达的调节。划痕试验、Transwell小室迁移实验验证细胞是否发生相应的侵袭、转移等生物学行为的改变。 结果PCR结果显示,microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638等microRNAs的表达趋势与芯片结果相同,microRNA的mimics和inhibitor达到预期效果,并且这些microRNAs的靶基因表达与筛选出的生物信息学分析结果相同；划痕试验显示除阴性对照组(N.C.)外的mimics组侵袭能力明显增强,并且各inhibitor组(除inhibitor N.C.组外)的侵袭能力有所减弱。Transwell小室迁移实验提示除阴性对照组(N.C.)外的mimics组迁移转移能力明显增强,inhibitor组的迁移转移能力有所减弱。 结论microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638等可通过靶向调控ACVR1C等基因的方式来在膀胱尿路上皮癌T24细胞的EMT进程中发挥作用,抑制这些microRNAs的表达则可抑制膀胱尿路上皮癌细胞的上皮间质化进程,进而影响其细胞的侵袭、迁移的能力。
[Abstract]:The first part was constructed by transforming growth factor - 尾1 - induced EMT - induced bladder urological epithelial cell carcinoma
Objective To explore the optimal induction concentration and induction time of EMT in human bladder urinary tract epithelial carcinoma ( BTCC ) by transforming growth factor - 尾1 ( TGF - 尾1 ) , and to verify the gene expression , biological behavior and so on .
Methods The expression level of TGF - 尾1 was detected by means of real - time fluorescence quantitative PCR , and the optimal concentration and induction time of TGF - 尾1 in EMT process were further verified by means of cell scratch test , Transwell chamber migration test and so on .
Results The changes of cellular morphological changes of 24 cells showed that the epithelial cells were interstitial after 36 h of TGF - 尾1 induced by lOng / ml .
At the same time , the expression level of EMT marker genes also changed accordingly , such as up - regulation of the expression levels of vimentin and MMP2 in the interstitial cell markers , downregulation of epithelial markers such as E - cadherin , and up - regulation of EMT factors such as downregulation of epithelial markers such as E - cadherin and the like ;
In addition , the cell scratch test showed that the difference of average healing area ( percentage ) between the two groups was significant ( 0.81 vs1 , P0.05 ) after lOng / ml TGF - 尾1 .
In the same way , the invasion of the cells in the group 24 - N . C . and 24 - TGF - 尾1 was detected by the Transwell chamber migration test , and the invasion ability of the cells was significantly increased in 10 ng / ml 24 - TGF - 尾1 group ( 54.6 vs 97.65 , P < 0.05 ) .
Conclusion The expression of EMT in the cells after induction of TGF - 尾1 at 10 ng / ml for 24 hours after induction of TGF - 尾1 with 10 ng / ml has been shown to be related to the expression of EMT , the invasion , penetration and far - distance migration of the cells .
In the second part , TGF - 尾1 - induced EMT - induced expression profiles of mRNA and microRNA in human EMT 24 cells were detected .
Objective To construct the expression profiles of microRNA expression profiles and mRNA expression in bladder urinary tract epithelial cancer cell line 24 induced by TGF - 尾1 factor .
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本文编号：1782135
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