基于尿液mRNA芯片检测的肾脏纤维化生物标志物研究

发布时间：2018-04-29 07:12

本文选题：荧光定量PCR芯片 + 尿液mRNA　；参考：《东南大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：肾脏纤维化(renal fibrosis, RF)是所有慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)进展的共同病理表现。肾脏纤维化发病机制复杂,其中局部炎症反应的形成、炎症介质释放、肾脏固有细胞(包括系膜细胞、足细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞等)活化和凋亡(或坏死)、胞外基质(extracellular matrix, ECM)堆积是导致肾脏结构毁损的共同关键环节。目前肾脏纤维化诊断主要依赖肾穿刺活检这一有创性检查手段,临床上尚缺乏无创性检查方法。近年来,尿沉渣细胞及其分子生物学信息检测技术日益成熟,可能为探索肾脏纤维化相关生物标志物提供崭新的无创技术平台。因此,本研究目的在于：基于尿液mRNA检测技术,构建可同时检测多种尿液mRNA水平的肾脏纤维化靶向荧光定量PCR (polymerase chain reaction)芯片,发现和验证CKD患者肾脏纤维化相关生物标志物,并对IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)患者肾脏纤维化进行联合生物标志物研究。方法：1.基于尿沉渣细胞：ml RNA检测技术,选出86种肾脏纤维化可能相关基因并构建靶向表达谱PCR芯片。选取50例经肾脏活检证实的CKD患者,利用所构建的real-time PCR芯片进行尿沉渣mRNA检测评估,分析芯片的灵敏度、特异度和可重复性分析。2.选取在东南大学附属中大医院住院治疗的135例经肾脏活检证实的CKD患者和31例健康对照(healthy control, HC),分为筛查组和验证组。使用所构建的肾脏纤维化靶向荧光定量PCR芯片检测尿沉渣细胞mRNA表达水平,分析目标基因在CKD患者和健康对照之间的表达差异,并与血肌酐(serum creatinine, Scr),尿素氮(blood urea nitrogen, BUN),肾小球滤过率(estimate glomerular filtration rate, eGFR),肾小球硬化(glomerular sclerosis, GS)积分和小管间质纤维化(tubular interstitial fibrosis, TIF)积分进行相关性分析,筛选出肾脏纤维化的生物标志物并在另一组CKD患者中进行验证,评价芯片所筛选的基因对肾脏纤维化的诊断价值。3.选取在东南大学附属中大医院住院治疗的74例经肾脏活检证实的IgA肾病患者和31例健康对照。构建由90个IgA肾病发生发展相关基因组成的IgA肾病靶向表达谱PCR芯片并通过芯片检测IgA肾病患者和健康对照的尿液mRNA,发现差异表达基因,并与肾功能指标、牛津分级(Oxford classification)、纤维化评分等相关性分析,筛选出IgA肾病肾脏纤维化相关候选基因标志物。利用线性判别分析(Fisher's linear discriminant analysis)对候选基因构建联合生物标志物,通过自身验证和交互验证评估联合标志物在IgA肾病患者中肾脏纤维化的诊断价值。结果：1.本研究构建的肾脏纤维化靶向PCR芯片可准确定量检测86种目的mRNA。该芯片基因扩增曲线图谱呈S型,熔解曲线分析呈单峰；所有样本基因检测阳性率均大于85%；PPC孔均值20.63±0.35,变异度仅为1.69%。2.通过芯片检测发现筛查组和验证组中CKD患者尿液VIM mRNA水平较健康对照组显著升高。Spearman相关性分析提示,VIM mRNA水平与血肌酐、尿素氮、肾小球滤过率、肾小球硬化评分和小管间质纤维化评分之间存在显著相关。Multiple logistic regression进一步提示,尿液VIM mRNA表达水平是肾脏纤维化的重要危险因素并可有效区分不同严重程度的纤维化。3.IgA肾病肾脏纤维化相关PCR芯片90个候选基因中,有50个尿液mRNA在IgA肾病和健康对照中存在显著表达差异,其中BCL2、CASP3、PAI1、TIMP2、 VIM, P53、SYNPO、MCP-1、TGF-β1的mRNA水平与血清肌酐、eGFR和肾脏纤维化评分显著相关。利用BCL2、PAI1、TGF-β1三个基因构建的联合标志物可有效诊断IgA肾病患者肾脏纤维化水平,其中敏感性、特异性、约登指数分别为91.3%,85.7%,0.77,ROC分析提示曲线下面积为0.92(P0.05)。结论：1.本研究首次构建了一种肾脏纤维化靶向的荧光定量PCR芯片。所构建的纤维化靶向PCR芯片具有良好的灵敏度、特异度和可重复性,为肾脏纤维化无创性诊断提供了新的技术平台。2.尿液VIM mRNA水平可有效区分不同严重程度的纤维化状态,提示尿液VIMmRNA可能作为肾脏纤维化无创性诊断标志物。3.尿液肾脏纤维化相关BCL2, PAI1和TGF-β1mRNA构建的联合标志物优于传统肾功能相关标志物和单一基因标志物,可能成为反映IgAN进展的新型生物标志物。
[Abstract]:Objective : Renal fibrosis ( RF ) is a common pathological manifestation of the progression of chronic kidney disease ( CKD ) . Objective To evaluate the diagnostic value of renal fibrosis in patients with IgA nephropathy by means of linear discriminant analysis ( Fisher ' s linear discriminant analysis ) .
The positive rate of all samples was more than 85 % .
The results showed that the level of mRNA in urine was significantly correlated with serum creatinine , urea nitrogen , glomerular filtration rate , glomerular sclerosis score and renal fibrosis score .

【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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