LSD1抑制剂TCP体外对肾癌786-O细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-05-01 20:51

  本文选题：肾透明细胞癌 + 反苯环丙胺　； 参考：《南昌大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 初步研究赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)抑制剂反苯环丙胺对肾透明细胞癌786-O细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其机制。 方法： 1、细胞活力实验：细胞培养成功后行MTT实验检测不同浓度梯度下的反苯环丙胺（TCP）干预对数生长期的786-O细胞24h、48h和72h后的细胞生长抑制率，并设调零孔和对照组，计算50％致死浓度(IC50)，然后绘制浓度-时间抑制率曲线图；实验重复3次。 2、采用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）分析、计算细胞凋亡率，并绘制曲线图。 3、Trizol法提取实验组和对照组细胞总RNA，应用分光光度计法检测RNA浓度、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，使用半定量RT-PCR检测LSD1基因mRNA的表达量变化。 4、Western-blot检测实验组和对照组细胞LSD1蛋白表达量变化。 5、采用划痕试验观察TCP对786-O细胞迁移力的影响，拍照观察12h、24h和48h细胞迁移距离。实验重复3次。 6、Transwell细胞体外侵袭实验检测不同浓度梯度的TCP作用对数生长期的786-O细胞24h侵袭到Tanswell小室下室面的数目，同时设立对照组，予以0.1％的结晶紫染色后拍照。实验重复3次。 7、数据统计分析：所有数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS19.0统计软件包的单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义；以P0.01为差异有显著统计学意义；以P0.05为差异无统计学意义。 结果： 1、不同浓度(0、10、20、40、80、160和320uM)的TCP作用于786-O细胞24h、48h和72h后，MTT法检测结果显示，1‰的DMSO溶液对786-O细胞无影响，TCP对786-O细胞的增殖有抑制作用，10uM以上随药物浓度的增大、作用时间的延长，抑制作用随之增强，呈现明显的时间-剂量效应关系(P＜0.01)。计算出24h、48h和72h TCP的IC50值分别为133.76uM、67.66uM和36.02uM。 2、流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测药物诱导细胞凋亡分析表明，TCP作用肾癌786-O细胞48h，0uM组、DMSO组和10uM组两两比较，凋亡率无统计学差异（P＞0.05），40uM-160uM组随浓度的增高，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。同时，细胞坏死率也同步增高，说明TCP具有细胞毒性作用，随药物浓度增高，毒性随之增大； 3、 TCP处理786-O细胞48h后LSD1基因mRNA表达量的分析，，40uM和80uM组的表达明显低于0uM组及1‰DMSO组LSD1基因mRNA表达量（P＜0.01）；0uM组与1‰DMSO组比较，结果无明显差异（P＞0.05）； 4、Western-blot分析TCP处理细胞48h后LSD1蛋白在786-O细胞中的表达情况，40uM和80uM组的表达明显低于0uM组及1‰DMSO组LSD1蛋白表达量（P＜0.01）；1‰DMSO组与0uM组比较，结果无明显差异（P＞0.05）； 5、采用划痕试验观察TCP对786-O细胞迁移力的影响，结果显示：0uM组24h及48h愈合率分别为35.14%±3.91%、59.46%±4.36%；1‰DMSO组24h及48h愈合率分别为38.12%±3.86%、56.52%±4.68%；40uM组处理24h后愈合率为28.64%±3.15%、处理48h愈合率为39.72%±4.11%；80uM组处理24h愈合率为21.11%±4.18%、处理48h愈合率为30.81%±3.74%。TCP处理786-O细胞后，细胞的迁移能力明显低于0uM组和1‰DMSO组，差异有统计学意义（P0.05）。0uM组和1‰DMSO组比较，迁移力无明显差异（P0.05)。表明TCP处理后786-O细胞迁移能力明显下降，且与时间和浓度呈正相关，1‰DMSO对786-O细胞的迁移力无影响； 6、应用Transwell小室检测TCP对肾癌786-O细胞侵袭能力的影响，TCP以40、80uM作用肾癌786-O细胞24h，对照组(0uM组、1‰DMSO组)亦作用24h。结果发现0uM组、1‰DMSO组两两比较，侵袭到平铺基质胶的Transwell小室下室面的细胞数无明显差异，分别为286.25±25.81和294.82±24.36，说明1‰DMSO对768-O细胞的侵袭能力无明显影响；40uM和80uM组侵袭到小室下室面的细胞数分别为195.86±19.43和115.76±18.56，表明随浓度的增高，穿过Transwell小室膜的细胞数逐渐减少，细胞的侵袭力逐渐下降(P0.05)。与对照组相比差异具有显著性(P＜0.01)。说明TCP对786-O细胞侵袭数目的抑制呈浓度依赖性。 结论： 1、LSDl抑制剂TCP在体外可以抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增殖，且呈浓度-时间依赖性； 2、TCP可以诱导体外培养的肾透明细胞癌786-O细胞凋亡，且呈浓度依赖性； 3、TCP可以抑制LSD1基因mRNA和蛋白的表达； 4、TCP在体外可有效抑制肾透明细胞癌细胞786-O的迁移和侵袭能力,并呈浓度依赖性。
[Abstract]:Objective:
The effect of lysine specific demethylase 1 (LSD1) inhibitor anti phenylalanine on the proliferation, apoptosis, migration and invasion of 786-O cells in renal clear cell carcinoma cells was preliminarily investigated and its mechanism was preliminarily discussed.
Method锛

本文编号：1831002