miRNA介导选择性表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体抑制肾癌细胞生长

发布时间：2018-05-01 22:15

  本文选题：肾细胞癌 + 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体　； 参考：《吉林大学》2014年博士论文

【摘要】：肾细胞癌是常见的肾脏肿瘤，占肾脏肿瘤的第三位，其发病率逐年增高，且有易发于老年，男性较女性更为常见。肾细胞癌治疗主要依赖手术及腹腔镜等手段，故大多数患者常被术后并发症以及放化疗的副作用所困扰，大大降低了生活质量。因此寻找特异的治疗靶点及治疗手段十分重要。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）做为TNF家族成员，能够诱导肾细胞癌肿瘤细胞凋亡。本研究的目的在于通过miRNA反应元件MRE，调控TRAIL在癌症细胞组织与正常细胞组织中的表达，从而选择性杀伤肿瘤细胞，对正常组织器官不产生细胞毒性。具体研究如下： 1实验路线 1.1miR-138, miR-199在肾癌细胞系、组织中与正常细胞系、组织中的表达。 1.1.1HK-2人正常肾上皮细胞系，ACHN和786-O细胞系和L-02人正常肝细胞培养。 1.1.2通过实时定量PCR比较RCC细胞系和正常细胞系miR-138和miR-199表达水平的差异。 1.1.3收集患者的肾癌和正常肾组织新鲜组织。 1.1.4通过实时定量PCR检测比较肾细胞癌组织和正常肾组织中miR-138，miR-199表达水平的差异。 1.2在miR-138，miR-199的MRE的控制下，RCC细胞外源基因的表达。 1.2.1通过将这些的MRE的两个拷贝到荧光素酶的载体编码区的下游部位，产生psiCheck2-3MREs。 1.2.2psiCheck2和psiCheck2-3MREs的转染HK-2，L-02，ACHN和786-O细胞，48小时后确定用双荧光素酶报告系统确定其荧光素酶活性。 1.3TRAIL在RCC细胞内的腺病毒载体下miR-138，miR-199的MRE的调节介导的表达。 1.3.1将miR-138，miR-199的MRE的两个拷贝放入开放阅读框后面的生成AD-TRAIL-3MREs。 1.3.2免疫印迹比较Ad-TRAIL，AD-TRAIL-3MREs与Ad-EGFP转染后，在L-02和ACHN上TRAIL表达的差异。 1.3.3实时定量PCR比较Ad-TRAIL，AD-TRAIL-3MREs与Ad-EGFP转染后，在L-02肝细胞和ACHN上TRAIL表达的差异。 1.4miR-138, miR-199在细胞内调控腺病毒载体，进而影响TRAIL在RCC细胞中的表达。 1.4.1通过免疫印迹和实时定量PCR比较转染miR-138，miR-199和抑制剂L-02之间TRAIL表达水平差异。 1.4.2通过免疫印迹和实时定量PCR比较转染miR-138，miR-199和抑制剂ACHN之间TRAIL表达水平差异。 1.5western blot和G0/G1细胞比值检测比较由Ad-TRAIL-3MREs诱导ACHN细胞和L-02细胞的凋亡。 1.6MTT检测在各种重组腺病毒感染下，各种RCC细胞和正常细胞的活性。 1.7在各种重组腺病毒感染下，检测动物体内ACHN诱发的RCC肿瘤生长情况，在RCC肿瘤组织中TRAIL和凋亡转导通路的表达 1.8调查TRAIL诱导的肝细胞毒性。 1.8.1从无肿瘤但给予PBS和重组腺病毒小鼠身上获取血液和血清。 1.8.2ELISA检测血ALT水平 1.8.3western blot检测给予重组腺病毒后肝组织TRAIL和凋亡转导通路的表达。 2结果 2.1评价RCC和正常细胞miR-138，miR-199的表达水平。与正常对照组比较，RCC组织和RCC细胞系中，miR-138，miR-199被认为是低表达。在正常肾细胞HEK-293和肝细胞L-02中，miR-138，miR-199过表达。 2.2miR-138，，miR-199的MRE限制正常细胞内外源基因的表达。 与psiCheck2转染组相比，转染psiCheck2-3MREs组的HEK-293和L-02细胞的荧光素酶表达水平被大大地抑制。然而，转染psiCheck2和psiCheck2-3MREs RCC细胞系之间的荧光素酶活性没有显著差异。 2.3L-02和ACHN细胞转染Ad-TRAIL, Ad-TRAIL-3MREs和Ad-EGFP后，检测TRAIL蛋白的表达。 AD-TRAIL转染的L-02和ACHN细胞表达的TRAIL能力没有差别。与此相反，在Ad-TRAIL-3MREs感染的L-02细胞，TRAIL的表达被大大地抑制，但在ACHN细胞TRAIL表达则无影响。 qPCR实验进一步证实，TRAIL的mRNA可以在Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs感染的ACHN细胞以及Ad-TRAIL感染L-02细胞很容易地检测到。但在转染Ad-TRAIL-3MREs正常肝细胞无TRAIL mRNA表达。 2.4由于miR-138，miR-199在细胞内调节， Ad-TRAIL-3MREs转染的RCC细胞系中选择性表达TRAIL。 免疫印迹和qPCR实验表明，转染miR-138，miR-199抑制剂L-02细胞部分恢复TRAIL的表达。由于转染了miRNA相似物，增加了miR-138，miR-199的水平，ACHN肾癌细胞表达TRAIL适度降低。 2.5MRE调控腺病毒载体选择性表达TRAIL导致肾癌细胞的选择性凋亡。 在Ad-TRAIL感染L-02细胞和Ad-TRAIL或Ad-TRAIL-3MREs转染ACHN细胞上裂解的Caspase3和PARP蛋白的高表达。Ad-TRAIL-3MREs转染的L-02转导的细胞Caspase3和PARP没有改变。 Ad-TRAIL感染L-02细胞和用Ad-TRAIL或Ad-TRAIL-3MREs转染的ACHN细胞中sub-G0/G1细胞的比值增加。然而，Ad-TRAIL-3MREs转染的L-02细胞sub-G0/G1的比例是相当低的。 2.6Ad-TRAIL-3MREs能够诱导RCC细胞的细胞毒性而不损伤正常细胞。 这些数据表明，AD-TRAIL在降低癌细胞和正常细胞的生存没有任何歧视。与此相反，AD-TRAIL-3MREs在诱导RCC细胞毒性时有一个高选择性。 2.7在体内生长的RCC可以通过AD-TRAIL-3MREs治疗来抑制。 用Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs治疗的小鼠中，极大地抑制ACHN异种移植的肿瘤。TRAIL表达的免疫印迹分析表明，注射Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-3MREs肿瘤之间TRAIL的表达无显著差异。另外，在两组肿瘤中检测出caspase3和PARP的裂解。 2.8Ad-TRAIL-3RMEs能够保护肝脏避免TRAIL诱导的凋亡。 用Ad-TRAIL治疗的小鼠ALT水平显著提高。与用Ad-EGFP和PBS对照相比，用Ad-TRAIL-3MREs治疗的小鼠血清ALT水平没有发生变化。此外，TRAIL与细胞凋亡相关蛋白的免疫印迹分析表明，AD-TRAIL激活肝组织凋亡途径，而AD-TRAIL-3MREs没有影响肝细胞的状态。 3结论 3.1在RCC细胞和组织与正常的人相比较miR-138，miR-199的水平降低。 3.2miR-138，miR-199的MRE可以有效地抑制在正常细胞外源基因的表达。 3.3miR-138，miR-199的MRE可以用于限制在RCC细胞腺病毒介导的TRAIL的表达。 3.4miR-138，miR-199的水平控制腺病毒载体介导的TRAIL选择性表达。 3.5TRAIL选择性表达能够诱导RCC特异性凋亡。 3.6MRE调节的腺病毒是对正常细胞无细胞毒性的，有针对性的抗肿瘤剂。 3.7Ad-TRAIL-3MREs能够经由TRAIL诱导的细胞凋亡抑制的RCC肿瘤在小鼠中的生长。 3.8MRE调控TRAIL表达避免了TRAIL诱导的肝毒性。
[Abstract]:Tumor necrosis factor - related apoptosis - inducing ligand ( TRAIL ) is a member of TNF family .

1 Test Route

1.1 Expression of miR - 138 , miR - 199 in renal cancer cell lines , tissues , and normal cell lines , tissues .

1.1 . 1HK - 2 human normal renal epithelial cell lines , ACHN and 786 - O cell lines and L - 02 human normal hepatocytes culture .

1.1 . 2 Compare the differences in expression levels of miR - 138 and miR - 199 in RCC cell lines and normal cell lines by real - time quantitative PCR .

1.1 . 3 Collect patient renal cancer and normal kidney tissue fresh tissue .

1.1 . 4 Comparison of miR - 138 , miR - 199 expression levels in renal cell carcinoma tissues and normal kidney tissues was detected by real - time quantitative PCR .

1.2 Under the control of miR - 138 and miR - 199 , the expression of the foreign gene of the RCC cell is expressed .

1.2 . 1 psiCheck2 - 3Mashed is generated by copying the two copies of the MREs to the downstream portion of the vector encoding region of the luciferase .

1.2 . 2psiCheck2 and psiCheck2 - 3Mbytes transfected HK - 2 , L - 02 , ACHN and 786 - O cells , and after 48 hours , the luciferase activity was determined using a dual luciferase reporter system .

1 . Regulation - mediated expression of miR - 138 , miR - 199 in an adenovirus vector in an RCC cell .

1.3 . 1 Two copies of miR - 138 , miR - 199 were placed into an open reading frame to generate AD - TRAIL - 3Masked .

1.3 . 2 The difference of TRAIL expression on L - 02 and ACHN after Ad - TRAIL , AD - TRAIL - 3MRNA and Ad - EGFP were compared with Western blot .

1.3 . 3 The difference of TRAIL expression between Ad - TRAIL , AD - TRAIL - 3MRNA and Ad - EGFP was compared between Ad - TRAIL , AD - TRAIL - 3MRNA and Ad - EGFP by real - time quantitative PCR .

1.4miR - 138 , miR - 199 regulates the adenovirus vector in the cell , thereby influencing the expression of TRAIL in the RCC cell .

1.4 . 1 The level difference of TRAIL expression between miR - 138 , miR - 199 and inhibitor L - 02 was compared by Western blot and real - time quantitative PCR .

1.4 . 2 The level difference of TRAIL expression between miR - 138 , miR - 199 and inhibitor ACHN was compared by Western blot and real - time quantitative PCR .

1 . The apoptosis of ACHN cells and L - 02 cells was induced by Ad - TRAIL - 3MRNA compared with the ratio of 1 . 5western blot and G0 / G1 cell .

1 . The activity of various RCC cells and normal cells was detected by MTT assay in various recombinant adenovirus .

1.7 In the presence of various recombinant adenovirus , the growth of ACHN - induced RCC tumors in animals was detected , and the expression of TRAIL and apoptotic signal transduction pathways in RCC tumor tissues was detected .

1.8 Investigation of TRAIL - induced hepatocyte toxicity .

1.8 . 1 Blood and serum were obtained from tumor - free but administered PBS and recombinant adenovirus mice .

1.8 . 2ELISA Test Serum ALT Level

1.8 . 3Western blot was used to detect the expression of TRAIL and apoptotic signal transduction pathways after recombinant adenovirus .

2 Results

2.1 The expression level of miR - 138 and miR - 199 in RCC and normal cells was evaluated . Compared with the normal control group , miR - 138 and miR - 199 were considered to be low expression in RCC tissues and RCC cell lines .

2.2miR - 138 and miR - 199 can inhibit the expression of endogenous and external genes in normal cells .

The luciferase expression levels of HEK - 293 and L - 02 cells transfected with psiCheck2 - 3MRNA group were significantly inhibited compared to psiCheck2 transfection group . However , luciferase activity between transfected psiCheck2 and psiCheck2 - 3Mashed RCC cell lines was not significantly different .

2.3L - 02 and ACHN cells transfected Ad - TRAIL , Ad - TRAIL - 3MRNA and Ad - EGFP to detect the expression of TRAIL protein .

In contrast , TRAIL expression was significantly inhibited in Ad - TRAIL - 3MRNA - infected L - 02 cells , but no effect on TRAIL expression in the ACHN cells . The qPCR assay further demonstrated that TRAIL mRNA was readily detectable in the ACHN cells infected with Ad - TRAIL and Ad - TRAIL - 3MRNA and Ad - TRAIL - infected L - 02 cells . However , there was no TRAIL mRNA expression in the transfected Ad - TRAIL - 3MRNA normal hepatocytes .

2.4 As a result of miR - 138 , miR - 199 selectively expresses TRAIL in an RCC cell line transfected with Ad - TRAIL - 3Mashed in intracellular regulation .

Western blot and qPCR experiments showed that miR - 138 , miR - 199 inhibitor L - 02 cell partially recovered the expression of TRAIL . The level of miR - 138 , miR - 199 was increased due to the transfection of miRNA similarities , and the expression of TRAIL in ACHN kidney cancer cells was moderately reduced .

2 . The selective expression of TRAIL in the adenovirus vector induced by 2.5 MREs results in the selective apoptosis of renal cancer cells .

high expression of caspase3 and parp proteins cleaved with Ad - TRAIL - infected L - 02 cells and Ad - TRAIL or Ad - TRAIL - 3Mrna transfected ACHN cells . Ad - TRAIL - 3 Mashed L - 02 transduced cells caspase3 and parp were not altered .

Ad - TRAIL - infected L - 02 cells and the ratio of sub - G0 / G1 cells in ACHN cells transfected with Ad - TRAIL or Ad - TRAIL - 3Mashed increased . However , the ratio of Ad - TRAIL - 3 Mashed L - 02 cells sub - G0 / G1 was rather low .

2.6Ad - TRAIL - 3MRNA can induce cytotoxicity of RCC cells without damaging normal cells .

These data suggest that AD - TRAIL does not discriminate against the survival of cancer cells and normal cells . In contrast , AD - TRAIL - 3Methical has a high selectivity in inducing the toxicity of RCC cells .

2.7 RCC that is grown in vivo may be inhibited by AD - TRAIL - 3 Malone therapy .

Western blot analysis of TRAIL expression in mice treated with Ad - TRAIL and Ad - TRAIL - 3Masks showed no significant difference in the expression of TRAIL between Ad - TRAIL and Ad - TRAIL - 3Mashed tumors . In addition , cleavage of caspase3 and parp was detected in both groups of tumors .

2.8Ad - TRAIL - 3RRA can protect the liver from TRAIL - induced apoptosis .

The ALT level of mice treated with Ad - TRAIL was significantly improved . Compared with control with Ad - EGFP and PBS , the serum ALT level of mice treated with Ad - TRAIL - 3Malone did not change . In addition , Western blot analysis of TRAIL and apoptosis - related protein showed that AD - TRAIL activated the pathway of apoptosis , while AD - TRAIL - 3Malone did not affect the status of hepatocytes .

3 Conclusion

3.1 miR - 138 , miR - 199 levels were reduced in RCC cells and tissues compared to normal human phases .

3.2miR - 138 and miR - 199 can effectively inhibit the expression of exogenous gene in normal cells .

3.3miR - 138 , the MREs of miR - 199 can be used to limit the expression of TRAIL in RCC cell adenovirus .

3.4miR - 138 , miR - 199 levels control the selective expression of TRAIL - mediated TRAIL .

3.5TRAIL selective expression can induce RCC - specific apoptosis .

3.6 The adenovirus - regulated adenovirus is non - cytotoxic to normal cells and targeted anti - tumor agents .

3.7Ad - TRAIL - 3MRNA was able to grow in mice via TRAIL - induced apoptosis - inhibiting RCC tumors .

3 . The expression of TRAIL in regulation of TRAIL avoids TRAIL - induced liver toxicity .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11

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