PPP5C对前列腺癌恶性生物学功能的调控及机制研究

发布时间：2018-05-20 19:41

  本文选题：PPP5C + 前列腺癌　； 参考：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：一、研究背景男性前列腺肿瘤(PCa)是男性所特有的恶性疾病,其发病相对其他疾病比较隐匿。在早期情况下,患者往往无明显不适症状。根据ACS在2016年发布最新的数据显示,前列腺肿瘤在其全国范围内分别位居新发病例的首位和致死病例的第二位。在中国,近些年前列腺癌的发病率也逐渐在升高,根据国家肿瘤中心2015年的数据提示前列腺癌目前在男性恶性肿瘤发病率和死亡率已经接近膀胱癌。针对早期局限性前列腺癌的治疗,目前主要的治疗手段是以手术为主的根治性治疗,其5年生存率可达到百分之九十九以上,预后极佳。而对于中晚期的前列腺癌,5年生存率在28%-32%之间,疗效欠佳。内分泌治疗是前列腺恶性肿瘤最重要的治疗方式,针对预期寿命10年,术后生化复发,或者晚期转移性患者,其具有疗效佳、创伤低、并发症少等优势。但是,内分泌治疗的患者平均在一年半到两年的时间内容易转变为CRPC的患者,导致肿瘤迅速进展。因此,深入探索前列腺癌进展的靶点,并进一步探讨可能的潜在的机制,从而为前列腺癌的早期诊断、进展检测以及综合治疗提供依据是目前泌尿肿瘤外科领域的热点。PPP5C是丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶家族主要成员之一,在细胞生命活动比如应激等当中构成复杂的调控网络。目前发现PPP5C参与调节的生理活动包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞损伤修复以及激素代谢等,可涉及到MAPK、ATM、ATR、P53、GR以及ASK1等重要的信号转导通路以及信号分子。近些年来,有文献报道PPP5C基因的异常与多种肿瘤相关。敲除PPP5C的表达后,能够抑制胶质瘤、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长,并且能够抑制多种恶性细胞的转移能力。同时文献报道在过表达PPP5C后的乳腺癌小鼠模型中,肿瘤细胞的增殖明显增快。因此,PPP5C与多种恶性肿瘤的相关性已经得到证实,但是其相关机制仍尚未阐明。本课题基于对前列腺癌患者手术组织标本以及Oncomine芯片数据库中前列腺癌标本以及癌旁标本的PPP5C表达水平的检测,并利用慢病毒介导的途径构建PPP5C敲减细胞系模型来进一步研究PPP5C对于前列腺癌的调控及下游潜在的调节机制。二、研究目的在前列腺癌患者手术标本以及公开的芯片数据库中分析PPP5C的表达水平,并进一步探讨PPP5C对前列腺癌细胞肿瘤学特性及下游关键的调控机制。三、研究方法(一)ppp5c在前列腺癌手术组织标本的蛋白表达水平检测及利用oncomine芯片数据库进行相关性分析2014.9月-2015.9月于第二军医大学附属长征医院收集前列腺癌患者行腹腔镜下前列腺癌根治术的手术标本,在液氮中保存。每例患者配对收集癌组织与癌旁组织,共获得52例前列腺癌与前列腺癌旁组织标本,根据标准化流程制备成冰冻石蜡切片,运用ich检测ppp5c在癌及癌旁组织的蛋白水平,同时收集52例手术患者的一般临床资料和手术病理结果的信息,进行分析。应用oncomine芯片数据库,获取公开的芯片相关数据资料,摘录ppp5c在前列腺癌与癌旁组织的mrna值,开展比较分析。(二)前列腺癌细胞系中ppp5c的基础表达水平检测并通过慢病毒介导构建前列腺癌ppp5c敲减细胞株模型应用实时定量基因扩增荧光检测系统(real-timequantitativepcrdetectingsystem,qpcr)检测不同前列腺癌细胞株(lncap,22rv1,pc3,du145)ppp5c基因的mrna表达水平以及蛋白免疫印迹(westernblotting,wb)的方法检测前列腺癌细胞株中ppp5c的蛋白水平。选取ppp5c水平较高的pca细胞株作为构建沉默ppp5c的候选细胞株。根据ppp5c基因序列,设计能够靶向ppp5c的shrna并插入到含有绿色荧光检测系统的质粒,进一步构建能够稳定靶向沉默ppp5c并且含有绿色荧光基因的慢病毒载体lv-shppp5c。将lv-shppp5c感染候选细胞株,利用绿色荧光评估感染效率,利用real-timeqpcr以及westernblotting分别评估受感染细胞株的mrna情况以及蛋白情况以评估敲减效率。(三)检测ppp5c基因低表达后的前列腺癌细胞株细胞增殖、克隆形成、细胞迁移能力变化以及细胞周期、细胞凋亡水平变化在ppp5c沉默组(lv-shppp5c)、空质粒组(lv-shcon)、空白对照组(con)三组中开展肿瘤细胞恶性生物学功能实验,mtt、克隆形成评估各个细胞的增殖特性,划痕实验的愈合能力结果评估恶性肿瘤细胞的迁移特性,流式细胞术结合pi染色法检测细胞分裂各个时相分布变化,采用流式细胞术结合annexinv/pi双染色法检测肿瘤细胞凋亡情况。(四)ppp5c对前列腺癌恶性生物学调控的下游机制的初步探索在前期稳定沉默ppp5c基因表达的基础上,进行蛋白水平下游机制分析。培养细胞、样本收集、蛋白裂解以及开展蛋白免疫印迹评估下游蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的变化。四、研究结果(一)ppp5c的蛋白分子水平在前列腺癌组织中较癌旁组织中相对上调通过临床手术标本收集共得到52对前列腺癌组织及癌旁组织,通过免疫组织化学染色分析,发现ppp5c的蛋白水平在pca当中升高,存在统计学差异。pca组织切片中的ppp5c免疫组化结果提示其在癌中深度较癌旁组织深,阳性细胞数较癌旁多。(二)oncomine芯片数据库进一步在mrna水平验证ppp5c在前列腺癌中高表达并在转移性组织中升高利用oncomine芯片数据库分析前列腺癌mrna相关分子水平,摘录前列腺癌组织及前列腺癌旁组织中的ppp5c表达水平并进行统计分析。发现在4个数据库中ppp5c的表达在pca中显著升高,具有统计学差异。进一步比较pca转移灶组织与原位pca中ppp5c的mrna表达水平,发现转移性pca组织在4个数据库中明显比原位pca组织上调,具有统计学差异。(三)利用shrna介导的途径构建ppp5c低表达水平的pca细胞株模型real-timeqpcr以及westernblotting检pca各细胞系ppp5c水平,发现在pca常见细胞株均有ppp5c的表达。并且在du145、pc3、22rv1中ppp5c的表达较lncap高。慢病毒lv-shppp5c感染du145、pc3、22rv1细胞系,real-timeqpcr以及westernblotting实验显示ppp5c在实验组中成功低表达,稳定低表达ppp5c的pca细胞株模型构建成功。(四)稳定沉默PPP5C水平后DU145、PC3、22RV1的增殖及克隆形成明显受到抑制MTT实验显示在三个前列腺癌细胞株中稳定沉默PPP5C组较对照组细胞增殖能力减弱,增殖曲线抑制,具有显著差异。并且lv-shPPP5C组细胞克隆数量明显减少,其形状显著变小。(五)PPP5C敲减诱导DU145、PC3、22RV1细胞周期阻断在G0/G1期利用PI染色,流式细胞术分析技术显示DU145、PC3、22RV1细胞系中lv-shPPP5C组G0/G1期上调,S期、G2/M期不同程度下降,具有统计学差异。(六)PPP5C沉默导致DU145、PC3、22RV1凋亡增加Annexin V/PI染色法结合流式细胞术分析,DU145、PC3、22RV1细胞稳定沉默PPP5C组中Annexin V(+)/PI(-)较对照组上升,同样Annexin V(+)/PI(+)较对照组升高,说明敲减PPP5C诱导PCa细胞凋亡增加。(七)PPP5C低表达抑制DU145、PC3的迁移能力划痕实验提示DU145、PC3在低表达PPP5C后其划痕的修复能力明显减弱,实验组切口愈合面积较对照组降低,具有统计学差异。(八)PPP5C沉默细胞株中JUK以及ERK磷酸化水平增加在沉默了PPP5C基因组的模型中,WB实验显示其JNK、ERK的非磷酸化水平无明显变化,而磷酸化的JNK、ERK水平明显上调,并且发现c-PARP升高、CDK4下调。五、研究结论本课题表明PPP5C分子在PCa中发挥重要的功能,其在癌组织中异常高表达。沉默PPP5C表达后,前列腺癌的恶性生物学功能细胞增殖、克隆能力、迁移能力都受到抑制,凋亡增加以及周期阻滞。WB水平检测提示其JNK及ERK分子的磷酸化水平增加,凋亡相关的蛋白分子c-PARP增加以及周期相关蛋白CDK4表达降低,预示PPP5C是促进PCa进展的潜在的分子靶标。
[Abstract]:In recent years , it has been reported that PPP5C is one of the most important treatments for prostate cancer , and it has the advantages of good curative effect , low trauma and less complications . The expression level of ppp5c in prostate cancer cell line was determined and the expression level of ppp5c in prostate cancer cell line was determined . (鍥，

本文编号：1915974