肝再生增强因子对肾间质纤维化的作用及机制研究

发布时间：2018-05-29 23:17

  本文选题：肝再生增强因子 + 上皮细胞-间充质细胞转分化　； 参考：《重庆医科大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分ALR对肾小管上皮细胞转分化的影响及机制 目的：肝再生增强因子（ALR）在缺血再灌注大鼠中表现出明显的肾脏保护作用，但其是否参与肾小管上皮细胞转分化（EMT）病理过程，目前尚不清楚。本研究拟通过建立肾小管EMT细胞模型，观察ALR是否参与EMT的病理过程，并探讨外源性给予重组人ALR（rhALR）对肾小管EMT的影响及其机制。 方法：建立转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管EMT细胞模型，先检测细胞内源性ALR蛋白及mRNA表达，再将细胞分为五组：①正常对照组；②单纯rhALR处理组；③单纯TGF-β1刺激组；④TGF-β1+20μg/ml rhALR处理组；⑤TGF-β1+80μg/ml rhALR处理组。酶联免疫法（ELISA）法检测培养上清液和胞质中的TGF-β1含量；蛋白免疫印迹和免疫荧光激光共聚焦检测上皮标记物E-钙粘蛋白及（肌）成纤维细胞标记物α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，实时荧光定量PCR检测细胞E-钙粘蛋白和波形蛋白mRNA水平；蛋白免疫印迹检测TGF-β1受体Ⅰ(TβRⅠ)、TGF-β1受体Ⅱ(TβRⅡ)及其下游Smads蛋白（Smad2、Smad4、Smad6、Smad7及磷酸化Smad2）、转录因子NF-κB和磷酸化NF-κB表达。 结果：蛋白免疫印迹检测和实时荧光定量PCR检测显示，与正常对照组比较，TGF-β1刺激组NRK-52E细胞内源性ALR蛋白及mRNA表达显著增加（P＜0.05）；ELISA检测显示，与正常对照组比较，单纯ALR处理组NRK-52E细胞培养上清液和胞浆中TGF-β1的含量无显著差异（P＞0.05）；蛋白免疫印迹检测显示，与正常对照组比较，TGF-β1刺激组NRK-52E细胞E-钙粘蛋白表达显著下降，而波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达显著上升，有统计学意义（P＜0.05）；与TGF-β1刺激组比较，TGF-β1+rhALR处理组E-钙粘蛋白表达上升，而波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达下降，有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；蛋白免疫印迹检测显示，与正常对照组比较，单纯rhALR处理组NRK-52E细胞TβRⅡ受体表达显著下降（P＜0.05），而TβR-Ⅰ受体、Smad2、Smad4、Smad6、Smad7蛋白及磷酸化Smad2、核因子NF-κB无显著差异（P＞0.05）；与单纯TGF-β1刺激组比较，TGF-β1+rhALR处理组细胞磷酸化Smad2和磷酸化NF-κB水平显著下降（P＜0.05）。 结论：ALR参与了肾小管EMT病理过程，rhALR可通过下调肾小管上皮细胞TβRⅡ受体表达、影响Smad2磷酸化水平及核因子NF-κB转录，从而抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT。 目的：我们的细胞实验结果表明，rhALR有抑制肾小管EMT的作用，那么，其是否在体内对肾间质纤维化存在影响呢？目前尚未知。本部分，拟通过建立肾间质纤维化动物模型，观察rhALR对肾间质纤维化的影响，并探讨其作用机制。 方法：建立大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型，60只SPF级SD大鼠随机分为四组：①假手术组(n=15)；②UUO模型组(n=15)；③UUO+低剂量rhALR（100μg/kg.d）处理组(n=15)；④UUO+高剂量rhALR（200μg/kg.d）处理组(n=15)。四组大鼠分别于术后第3、7、14天分批处死，留取手术侧肾脏组织。分别采用HE和Masson染色观察各实验组大鼠梗阻侧肾脏组织形态学改变；蛋白免疫印迹及免疫荧光激光共聚焦检测肾脏内源性ALR蛋白表达；蛋白免疫印迹检测肾脏组织E-钙粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白表达；实时荧光定量PCR检测肾脏组织波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白mRNA表达；蛋白免疫印迹检测肾脏组织TGF-β1、Smad-2、Smad-3及磷酸化Smad-2、-3蛋白表达。 结果：蛋白免疫印迹及免疫荧光激光共聚焦检测显示，，与假手术组比较，UUO模型组梗阻3天、7天大鼠肾脏内源性ALR表达显著增加（P＜0.05），与梗阻7天比较，梗阻14天大鼠肾脏内源性ALR表达显著下降（P＜0.05）；与UUO模型组比较，rhALR处理组大鼠梗阻侧肾脏Masson染色纤维化评分显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；蛋白免疫印迹检测显示，与UUO模型组比较，rhALR处理组大鼠梗阻肾脏E-钙粘蛋白表达上升，而纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与UUO模型组比较，rhALR处理组大鼠梗阻肾脏TGF-β1表达显著下降，有统计学意义（P＜0.05）；实时荧光定量PCR检测显示，与UUO模型组比较，rhALR处理组大鼠梗阻肾脏波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白mRNA表达显著下调（P＜0.05）。蛋白免疫印迹显示，与假手术组比较，UUO模型组大鼠梗阻侧肾脏磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表达显著升高（P＜0.05）；与UUO模型组比较，rhALR处理组大鼠梗阻肾脏磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表达显著减少（P＜0.05）。 结论：随着梗阻时间延长，梗阻肾脏ALR的表达呈先增加后下降的动态变化，而rhALR可通过抑制TGF-β1表达及下游信号蛋白Smad-2和Smad-3的磷酸化而显著减轻UUO大鼠梗阻肾脏间质纤维化，推测ALR可能在肾间质纤维化的病理过程中起一定作用。
[Abstract]:The Effect and Mechanism of the First Part on the Transdifferentiation of Renal Tubular Epithelial Cells

Objective : To observe the pathological process of renal tubular epithelial cell transdifferentiation ( EMT ) in renal tubular epithelial cells ( EMT ) , but it is not clear whether it is involved in the pathological process of EMT in renal tubular epithelial cells ( EMT ) .

Methods : The EMT cell model of renal tubular EMT induced by transforming growth factor - 尾1 ( TGF - 尾1 ) was established . The expression of endogenous alr protein and mRNA was first detected , then the cells were divided into five groups : 鈶

本文编号：1952854