镁离子对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化作用的研究

发布时间：2018-05-31 09:15

  本文选题：β-甘油磷酸 + 血管平滑肌肌细胞　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 高磷是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者血管中膜钙化的一个独立危险因素，可引起心血管事件等严重并发症，其诱导钙化的机制可能是通过血管平滑肌细胞（VSMC）膜上的Ⅲ型钠磷转运体（Pit-1）进入细胞内，引起VSMCs表型转化而发生钙化。进一步研究显示镁离子既可以抑制Pit-1通道活性而减少磷向细胞内转移，又可以竞争性地拮抗细胞内的磷，对细胞内的磷水平的调节起一定的作用，但镁离子与血管平滑肌细胞钙化的关系目前尚不清楚。本研究旨在通过高磷诱导的VSMCs钙化模型来探讨镁离子和VSMCs钙化两者之间的关系，以明确镁离子在VSMCs钙化中的作用。 方法： 1VSMCs原代培养 运用组织块贴壁法原代培养获取VSMCs，进行形态学及免疫细胞鉴定，并绘制正常平滑肌细胞生长曲线。 2实验分组及处理 VSMCs随机分为阴性对照组、高磷组及镁干预组，阴性对照组采用低糖DMEM含10%胎牛血清的正常培养基，高磷组在正常培养基的基础上加入10mmol/L β-甘油磷酸制成高磷培养基，镁干预组在上述高磷培养基的基础上加入氯化镁，使镁离子的终浓度分别为1mmol/L（镁干预组1）、2mmol/L（镁干预组2）和3mmol/L（镁干预组3），共刺激7d。 3不同浓度镁离子对VSMCs钙化的影响 VSMCs钙化检测分别用茜素红（Alizarin red stain）钙化染色和比色法测定细胞内钙含量的方法。 4不同浓度镁离子对钙化的VSMCs碱性磷酸酶（ALP）活性的影响 取3～5代细胞接种于6孔板，细胞密度约为2×105/孔，干预时间为7d，弃去培养基，PBS洗涤细胞2～3次，每孔加入500μL0.1％TritonX-100置4℃环境中约12～24h，然后反复吹打裂解细胞后置于离心管中离心，按化学发光法检测ALP活性。 5不同浓度镁离子对钙化的VSMCs Cbfα1mRNA表达的影响 运用RT-PCR方法研究不同浓度镁离子对VSMCs中Cbfα1mRNA水平表达的影响。 6统计学处理 数据统计采用SPSS13.0软件进行分析，实验结果用均数±标准差（x s）表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），多组间均数两两比较用SNK检验（Student-Newman-Keuls），以P0.05为差异有统计学意义。 结果： 1VSMCs原代培养 采用组织块贴壁法获取原代大鼠VSMCs，通常情况下贴壁的动脉组织块约3～4d后可爬出少许细胞，以长梭形为主，排列较分散，随着时间延长细胞数目显著增多，约6～7d细胞可铺满大部分瓶底。当细胞数目占瓶底面积的80～90%时可传代，传代后细胞起初为圆形或椭圆形，贴壁后可逐渐伸展为梭形，胞浆丰富，，核呈圆形或卵圆形，多个细胞交错重叠生长，呈典型的“峰-谷”样。用免疫细胞化学法检测平滑肌细胞特异性的抗体—α-平滑肌肌动蛋白抗体（α-SMA actin），其阳性结果为细胞胞浆强表达，呈棕黄色的免疫反应产物。 2不同浓度镁离子对VSMCs钙化的影响 运用茜素红钙化染色对VSMCs染色结果示：各实验组与阴性对照组相比，VSMCs钙化染色均不同程度地加重，而镁干预组与高磷组比较，随着镁离子浓度的增大钙化结节染色程度逐渐降低，当镁离子浓度为2mmol/L开始出现钙化结节缩小，呈浓度依赖性，3mmol/L时钙化结节显著降低，达最小状态。 运用比色法测定VSMCs内钙含量结果示：与阴性对照组相比，高磷组及镁干预组刺激VSMCs后，钙含量均显著增加，镁干预组与高磷组相比，钙含量随着镁离子的变化而变化，其结果呈负相关，即镁离子浓度越大，钙含量越低，并当镁离子浓度为2mmol/L开始钙含量明显降低，当镁离子浓度达3mmol/L时，钙含量检测结果也相应达最小值，且各组间比较差异具有统计学意义（P0.05）。 3不同浓度镁离子对钙化的VSMCs ALP活性的影响 镁离子刺激VSMCs后不同组间ALP结果示：与阴性对照组相比，高磷组及镁干预组VSMCsALP水平均不同程度地增加。镁干预组与高磷组比较，随着镁离子浓度的增大，ALP活性的变化趋势与钙含量结果相似，亦呈浓度依赖性，3mmol/L时ALP活性达最小值。 4不同浓度镁离子对钙化的VSMCs Cbfα1mRNA表达的影响 不同浓度镁离子刺激VSMCs后不同组间Cbfα1mRNA的表达结果示：与阴性对照组相比，高磷组及镁干预组的VSMCs Cbfα1mRNA水平均不同程度地增加，而镁干预组与高磷组比较，随着镁离子浓度的增大，Cbfα1mRNA水平也相应发生变化，变化趋势与镁离子浓度相关，呈浓度依赖性，当镁离子浓度为3mmol/L时mRNA水平降至最低，不同组间比较具有统计学意义。 结论： 1镁离子可抑制高磷诱导的VSMCs钙化，且呈浓度依赖性。 2镁离子抑制高磷诱导VSMCs发生钙化的机制可能是通过抑制VSMCs转分化作用来实现的。
[Abstract]:Objective:
High phosphorus is an independent risk factor for the calcification of the vascular membrane in chronic kidney disease (CKD) patients, which can cause serious complications such as cardiovascular events. The mechanism for inducing calcification may be by entering cells through the type III sodium and phosphorus transporter (Pit-1) on the membrane of vascular smooth muscle cells (VSMC), causing the transformation of the VSMCs phenotype. Further studies have shown that magnesium ions can inhibit the activity of Pit-1 channels and reduce phosphorus transfer to cells, and can antagonize the phosphorus in cells in a competitive manner, and play a role in the regulation of phosphorus levels in cells. However, the relationship between magnesium ion and vascular smooth muscle cell calcification is not clear. This study aims to induce high phosphorus induction. The VSMCs calcification model was used to investigate the relationship between magnesium ions and VSMCs calcification, so as to clarify the role of magnesium ions in VSMCs calcification.
Method锛

本文编号：1959105