O-GlcNAc糖基化对膀胱癌细胞自噬作用的调节及机制研究

发布时间：2018-06-04 12:34

本文选题：O-GlcNAc糖基化 + 细胞自噬　；参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景与目的:O-Glc NAc糖基化是一种动态的蛋白质修饰过程,其广泛参与细胞周期、基因转录、蛋白质翻译及信号转导等生命活动,越来越多的证据表明O-Glc NAc糖基化的异常修饰与肿瘤的发生、发展密切相关,而O-Glc NAc糖基化在膀胱癌中的作用与机制,尚未见报道。自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程,其在肿瘤发生、发展的过程中也发挥着重要作用。自噬作为细胞的一种重要的生理活动,受营养状态(包括O-Glc NAc糖基化)等多个应激因素调节,因此我们推测O-Glc NAc糖基化通过调节自噬而在膀胱癌中发挥作用。本实验旨在研究膀胱癌中O-Glc NAc糖基化对细胞自噬的调节作用,以及O-Glc NAc糖基化调节自噬的具体分子机制,并阐明O-Glc NAc糖基化修饰对膀胱癌细胞生物学行为的影响,从而为膀胱癌的基础研究提供新的视点,也为临床治疗膀胱癌提供新的思路。研究方法:1、选取人膀胱癌细胞株5637、RT4,分别使用O-Glc NAc糖基化抑制剂、O-Glc NAc糖基化增强剂及PBS处理细胞,检测细胞自噬的变化。检测指标包括荧光显微镜下观察自噬小体的数量,Western blot检测细胞自噬相关蛋白的表达。2、构建并筛选出5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA细胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA细胞株,5637-GFP-LC3/CTRL、5637-GFP-LC3/OGA-OE和5637-GFP-LC3/OGT-OE细胞株,荧光显微镜下观察自噬小体的数量,Western blot检测细胞自噬相关蛋白的表达。3、利用上述细胞株,使用不同方法调节细胞O-Glc NAc糖基化,Western blot检测自噬相关蛋白的表达,初步选出O-Glc NAc糖基化的靶蛋白。构建目的基因质粒并转染细胞,Western blot检测自噬相关蛋白的表达变化。IV4、利用上述细胞株,通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和Western blot实验,检测O-Glc NAc糖基化直接作用的靶蛋白。5、使用基因敲除和基因过表达的方法调节目的基因,Western blot检测O-Glc NAc糖基化及相关蛋白的表达。6、体外实验:调节5637、RT4细胞O-Glc NAc糖基化,检测细胞生物学活性的变化,包括:MTT和平板克隆形成能力检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;划痕实验和Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力。7、体内实验:将5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA细胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA细胞株分别皮下接种裸鼠,观察裸鼠及肿瘤生长情况,免疫组化检测肿瘤中糖基化、自噬等相关基因表达,同时关注肝、肺等转移情况。研究结果:1、使用O-Glc NAc糖基化抑制剂处理膀胱癌细胞5637、RT4后,荧光显微镜观察到细胞自噬增加,Western blot检测到自噬相关蛋白的增加;反之,使用O-Glc NAc糖基化增强剂处理膀胱癌细胞5637、RT4后,荧光显微镜观察到细胞自噬减少,Western blot检测到自噬相关蛋白的减少。2、使用基因修饰的方法抑制细胞O-Glc NAc糖基化,荧光显微镜观察到细胞自噬增加,Western blot检测到自噬相关蛋白的增加;反之,使用基因修饰的方法增强细胞O-Glc NAc糖基化,荧光显微镜观察到细胞自噬减少,Western blot检测到自噬相关蛋白的减少。3、将自噬相关基因ULK1质粒转入细胞株,Western blot检测到ULK1尤其是p-ULK1(S555)在细胞自噬中起重要作用。使用不同方法调节细胞O-Glc NAc糖基化,Western blot检测到p-ULK1(S555)的变化。4、使用不同方法调节细胞O-Glc NAc糖基化,Western blot检测发现:O-Glc NAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,细胞自噬增强;反之,O-Glc NAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,细胞自噬减弱。Co-IP实验显示:O-Glc NAc糖基化直接对AMPK修饰而发挥作用。5、成功构建AMPK缺失和过表达的细胞株,Western blot检测到:p-ULK1(S555)的表达受AMPK调控,在AMPK缺如的情况下O-Glc NAc糖基化变化未引起p-ULK1(S555)的改变。6、MTT和平板克隆形成实验示:低O-Glc NAc糖基化导致膀胱癌细胞增殖活力降低,高O-Glc NAc糖基化导致细胞增殖活力增强。流式细胞仪检测发现:低O-Glc NAc糖基化导致细胞G1期增加,G2/M期减少;高O-Glc NAc糖基化导致细胞G1期减少,G2/M期增加。细胞划痕实验和Transwell小室检测示:低O-Glc NAc糖基化导致膀胱癌细胞迁移和侵袭能力下降,高O-Glc NAc糖基化导致细胞迁移和侵袭能力增强。7、裸鼠皮下成瘤实验示:与对照相比,低O-Glc NAc糖基化组皮下移植瘤的体积和重量下降,高O-Glc NAc糖基化组皮下移植瘤的体积和重量增加;低O-Glc NAc糖基化组中远处转移下降,高O-Glc NAc糖基化组中远处转移增加。另外,免疫荧光证实低O-Glc NAc糖基化组中自噬增加,高O-Glc NAc糖基化组中自噬减少。研究结论:1、膀胱癌细胞中O-Glc NAc糖基化降低后,细胞自噬流增加;反之,O-Glc NAc糖基化增加后,细胞自噬流减少。即膀胱癌细胞中O-Glc NAc糖基化反向调节细胞自噬。2、自噬相关基因ULK1在自噬过程中起重要作用。膀胱癌细胞中O-Glc NAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,细胞自噬增强;反之,O-Glc NAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,细胞自噬减弱。即O-Glc NAc糖基化通过AMPK途径调节ULK1活性,而对细胞自噬产生影响。3、体外和体内实验证实O-Glc NAc糖基化对膀胱癌细胞生物学行为产生明显的影响:低O-Glc NAc糖基化抑制膀胱癌细胞增殖活力,高O-Glc NAc糖基化增强细胞增殖活力;低O-Glc NAc糖基化抑制膀胱癌细胞侵袭与转移能力,高O-Glc NAc糖基化增强细胞侵袭与转移能力。
[Abstract]:The effects of O - Glc nac glycosylation on cell autophagy and the mechanism of O - Glc nac glycosylation in bladder cancer were studied . The expression of autophagy - related protein was detected by Western blot . Western blot analysis showed that the expression of O - Glc nac glycosylation led to decreased proliferation of bladder cancer cells , decreased activity of ULK1 and decreased cell autophagy . The results showed that low O - Glc nac glycosylation resulted in decreased proliferation activity of bladder cancer cells , decreased activity of ULK1 and decreased cell autophagy . In vitro and in vivo experiments prove that the O - Glc nac glycosylation inhibits the proliferation of bladder cancer cells , the high O - Glc nac glycosylation enhances the proliferation activity of bladder cancer cells , the low O - Glc nac glycosylation inhibits the proliferation of bladder cancer cells , the high O - Glc nac glycosylation inhibits the invasion and metastasis of bladder cancer cells , and the high O - Glc nac glycosylation enhances the invasion and metastasis ability of the bladder cancer cells .
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14

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