E3泛素连接酶RNF138功能和分子机制以及RNF138和CTCF对DNA损伤应答分子机制的研究

发布时间：2018-06-12 18:27

本文选题：RNF138 + 基因敲除小鼠　；参考：《北京协和医学院》2016年博士论文

【摘要】：精子发生是雄性生殖细胞受高度复杂调控的发育过程,包括三个重要阶段：精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形。随着核固缩,线粒体重排,过渡蛋白和鱼精蛋白替换组蛋白,顶体形成等过程,最终形成具备传递父源遗传信息能力的终末分化生殖细胞-成熟精子。小鼠和大鼠高通量基因表达数据表明精子发生过程需要大量的睾丸特异性表达基因参与调控。据估计在小鼠的基因组中,大约有4%的基因特异表达于精子发生过程的各个阶段。RNF138,即RING (Really Interesting New Gene) Finger protein 138是本组前期在精子发生的研究工作中首先发现的含有RING Finger结构域且具有E3泛素连接酶活性的蛋白质。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3在内的一系列酶促反应协同完成。大量的研究证实,泛素化修饰除了参与蛋白质降解,还与蛋白激酶的激活、膜泡转运、DNA损伤修复和染色质重塑等一系列细胞生理过程密切相关。一些哺乳动物睾丸特异性表达的E3泛素连接酶在精子发生的不同阶段执行多种不同的生物学功能。其中一些E3泛素连接酶以及相关复合物在减数分裂过程早期的DNA双链断裂(DSB)和组蛋白修饰发挥重要作用。我们检测了不同日龄小鼠睾丸组织RNF138蛋白质表达水平,结果显示RNF138的表达量随睾丸发育阶段的成熟而增加,在第一波生精波(5周)完成时,开始趋于稳定,显示了其发育阶段表达特异性。免疫组化和免疫荧光结果显示RNF138在除精原细胞以外的各级生精细胞的胞浆均有不同程度的表达,尤其在初级精母细胞表达最高,在这个阶段初级精母细胞开始进入减数第一次分裂,这也提示RNF138可能参与生精细胞的早期发育。为了深入研究RNF138对雄性生殖的功能,我们利用Cre-loxP或者Flp-FRT同源重组系统构建了Vasa-Cre条件性基因敲除小鼠动物模型。结合RNF138基因敲除动物模型表型分析,与对照组比较发现RNF138基因条件性敲除小鼠各个发育阶段的睾丸重量和精子数量显著降低。形态学方面,RNF138基因敲除后早期的精子发生过程阻滞,早期部分生精细胞脱落,尤其是精母细胞数量显著减少。TUNEL结果显示精母细胞凋亡增加。转录组测序被广泛应用于功能基因组学研究中。转录组测序数据可以丰富和验证基因组数据的注释,同时用于不同样本间基因表达差异、可变剪接等的比较。大量且快速地充实样本的遗传数据,这些数据资源可有助于深入开展分子生物学机制研究。因此为了深入研究RNF138在雄性生殖中的作用机制,我们对条件性RNF138基因敲除小鼠睾丸进行转录组测序。差异表达基因共152个,与对照比较表达上调基因共73个,表达下调基因共79个。根据RNAseq差异表达基因分析,差异表达基因COG注释显示功能性分类中参与DNA复制,重组和修复的频率最高,这些结果提示RNF138在DNA损伤修复应答过程中参与重要功能。为了研究RNF138是否参与DNA损伤应答,我们利用激光损伤细胞发现RNF138富集在DNA损伤部位,且与DNA损伤标志γH2AX重叠。对RNF138进行动态监视显示RNF138快速有效招募到激光诱导的DNA损伤位点,而且这一过程依赖于RNF138的Zinc finger结构域。我们进一步发现RNF138是ATM的底物,可以被ATM在Ser124位点磷酸化。我们发现敲低RNF138后影响同源重组相关修复蛋白RAD51在DNA损伤位点的招募,且同源重组修复的效率显著降低。敲低RNF138后细胞对DNA损伤刺激非常敏感,且这一表型可以被野生型质粒拯救,说明RNF138直接参与DNA损伤修复过程。为揭示这一机制我们利用优化的TAP技术结合质谱发现RAD51D可以与RNF138相互作用,进而调控AD51D募集到DNA损伤位点的稳定性。另外我们对zinc finger结构域蛋白CCCTC结合因子(CTCF)在DNA损伤的功能和机制进行了探讨和研究。CTCF通过结合DNA链,限定常染色体和异染色体DNA之间的边界,调节染色质的结构。而CTCF在DNA损伤反应中的功能尚不清楚。我们发现CTCF迅速招募DNA损伤位点,这过程由锌指结构域和多聚ADP-核糖(PAR)介导。进一步的分析表明,只有三个锌指基序是识别PAR必需的。缺少这三个锌指,CTCF仍然可以与DNA结合。此外,CTCF敲低细胞对DNA损伤刺激电离辐射敏感。另外IR诱导的DNA损伤IRIF大小受CTCF的调控。这些结果表明,CTCF参与调节DNA损伤修复区域的边界。
[Abstract]:In order to study the expression of RNF138 , it is estimated that RNF138 may be involved in the early development of spermatogenic cells . We find that RNF138 is a substrate of ATM and can be phosphorylated by ATM at Ser124 site . It is found that RNF138 can interact with RNF138 and regulate chromatin structure . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage . In addition , CTCF is sensitive to DNA damage .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R697

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