Fyn在高糖诱导的足细胞损伤中的作用研究

发布时间：2018-06-17 13:39

  本文选题：Fyn + 高糖　； 参考：《山东大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病微血管并发症之一,临床主要表现为进行性发展的蛋白尿,最终可导致终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)。足细胞,即肾小球脏层上皮细胞,被覆于肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)上,是肾脏滤过屏障的重要组成部分。糖尿病肾病时肾小球的病理改变除了基底膜增厚和系膜基质的增生外,足细胞的数量和相关结构功能的病变在糖尿病肾病的发生发展过程中也起着重要作用,足细胞的损伤被认为是糖尿病肾病的一种早期病变。Fyn是Src家族酪氨酸激酶(Srcfamily tyrosine kinase, SFKs)的成员之一,可被多种刺激信号激活,调节下游信号通路,在细胞生长、粘附和运动性等方面发挥作用。既往研究证实,在足细胞中Fyn可与CD2AP以及synaptopodin相互作用,并且可以直接结合并磷酸化裂孔膜蛋白nephrin,介导足细胞形态和功能的改变。但对于Fyn信号途径是否参与介导了糖尿病肾病时的足细胞损伤及蛋白尿的发生,目前尚未有研究报道。本研究旨在探讨Fyn在高糖诱导的足细胞损伤中的作用,为糖尿病肾病的临床干预和治疗提供新的靶点。 方法： 1.足细胞的培养及分组：永生化小鼠足细胞系由美国哈佛医学院Peter Mundel教授惠赠。培养瓶采用I型胶原包被,在33℃条件下,以含有10%胎牛血清及10U/ml重组小鼠γ-干扰素的RPMI1640培养基培养5到7天使足细胞增殖,在37℃条件下,以含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养10到14天使足细胞分化成熟。足细胞分化成熟后随机分为5组：正常对照组,高糖组,高渗组,Fyn siRNA组和Control siRNA组。 2.足细胞相关指标的检测：应用real-time PCR及western b1ot分别从mRNA和蛋白水平检测各组足细胞nephrin、synaptopodin、desmin和vimentin的表达变化。 3.Fyn表达水平及Fyn活性的检测：应用小鼠足细胞特异性的Fyn siRNA干扰足细胞Fyn的表达,采用real-time PCR及western blot分别从mRNA和蛋白水平检测各组Fyn的表达,采用免疫沉淀及western blot检测各组足细胞中Fyn的活化情况(磷酸化Fyn-Tyr418). 结果： 1.高糖可诱导体外培养的足细胞出现损伤性改变。高糖组以含有30mM葡萄糖的高糖培养基刺激足细胞48小时,与正常对照组相比较,足细胞nephrin和synaptopodin的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P0.05); desmin和vimentin的mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P0.05)。 2.高糖刺激使足细胞Fyn的活化增加。与正常对照组相比较,高糖组足细胞Fyn的活性位点Tyr418磷酸化水平升高(P0.05),提示Fyn的蛋白激酶活性增强,而足细胞总Fyn的表达水平无明显变化(P0.05)。 3.干扰Fyn的表达可减轻由高糖诱导的足细胞损伤。应用特异性Fyn siRNA转染足细胞后再给予高糖刺激48小时,足细胞内nephrin和synaptopodin蛋白以及mRNA表达水平均较高糖组升高(P0.05),而desmin及vimentin蛋白以及mRNA的表达水平较高糖组降低(P0.05)。 结论：Fyn参与介导了高糖所诱导的足细胞损伤,通过干扰Fyn的表达可改善这一损伤。
[Abstract]:Purpose :

Diabetic nephropathy ( DN ) is one of the complications of diabetic microvascular complications . The clinical manifestations are the progressive development of proteinuria , which can lead to end - stage renal disease . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is a member of the family tyrosine kinase ( Srcfamily tyrosine kinase , SFKs ) .

Method :

1 . Culture and grouping of foot cells : The mouse full - term cell lines were donated by Professor Peter Mundel , Harvard Medical School in the United States . The culture flasks were cultured in RPMI 1640 medium containing 10 % fetal bovine serum and 10 U / ml recombinant mouse gamma - interferon at 33 鈩，

本文编号：2031250