GSK-3β及其下游信号分子在ABMR移植肾组织中的表达及其作用机制的研究

发布时间：2018-09-06 11:07

【摘要】：研究背景：在近几十年内,慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的发病呈现出逐年上升的趋势,我国目前CKD患者总数已经超过了1亿,而其中尿毒症患者占了100多万人,同时每年以20至30万的速度增加。目前,透析和肾移植术是治疗尿毒症的主要方法,相对于透析治疗,肾移植不但能够明显改善患者的生活质量,而且还能够提高患者的存活率。然而高额的手术费用,肾源的严重短缺,全国每年肾移植术不足1万例。如何更进一步提高移植肾的长期存活,如何做到对移植肾的相关病变早发现、早诊断、早治疗,阻断其进一步发展,维持长期良好的移植肾功能,是摆在我们每一位肾移植临床医生及移植相关科研工作者面前的一个重要课题。肾移植术作为治疗终末期肾病(ESRD)的最有效的方法之一,随着移植技术的不断完善和新型免疫抑制剂的出现,使得移植后急性排斥反应发生率明显下降,肾移植病人的短期存活率有了显著提高,人/肾1年存活率可以高达95%以上,但移植肾长期存活率提高不明显。肾移植术后患者移植肾丢失的主要原因是：患者死亡和慢性移植肾功能不全(chronic renal allograft dysfunction, CRAD),两者各占一半。在患者死亡的原因中常见的有：心血管疾病、肺部感染及恶性肿瘤等。CRAD已经成为阻碍移植肾长期存活的主要原因之一。在肾移植术1年后,CRAD平均以4%-6%的速度进行性增长。 CRAD定义为：肾移植术后至少3-6月以后,特别是在术后一年或数年后出现的移植肾功能进行性、不可逆性的功能减退和形态学改变,最终导致移植肾功能衰竭,而不得不恢复血液透析[1],其病理变化主要表现为：移植肾间质纤维化及小管萎缩(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)、广泛的血管病变及肾小球硬化,临床变现主要为：肌酐爬行性升高、蛋白尿和高血压等。CRAD是一个由多种因素相互作用、序贯性发展的进行性发展过程,导致CRAD发生的病因很多,例如：肾血管性病变、移植肾本身病变以及泌尿系统自身疾病等,在这些众多病因中,最常见的是移植肾自身疾病,包括免疫抑制剂的肾毒性、慢性移植肾肾病及肾脏原发性疾病复发等疾病。其他的疾病如：肾血管性病变、泌尿系梗阻等。这些危险因素可以来自供者,也可以来自受者；可以发生在肾移植后的早期,也可以发生在移植术后的晚期；可以源自患者自身,也可以源自医源性的因素。免疫和非免疫方面的因素均可导致CRAD的发生,非免疫因素包括：糖尿病、高血压、高脂血症、尸体供肾、边缘供肾、老年供肾、移植肾功能延迟恢复、蛋白尿、巨细胞病毒感染、缺血／再灌注损伤、免疫抑制剂的毒副作用(主要是钙调神经磷酸酶抑制剂,如：环孢素,FK506等)；免疫因素主要包括：体液免疫应答、细胞免疫应答以及HLA错配率、急慢性排斥反应、医院性因素(免疫抑制力不足)。其中,抗体介导的慢性排斥反应(chronic antibody-mediated rej ection, ABMR)是CRAD的免疫性因素。机体的炎症反应是损伤和修复的矛盾统一体,是一个统一的病理生理过程。肾脏在受到各种损伤因素的作用后,肾内毛细血管受到刺激,发生痉挛,引起肾内微循环受阻,肾组织发生缺血、缺氧,激活了肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等细胞产生和分泌相关炎症介质,这当中同时包含了促炎介质以及炎症趋化因子；同时血液中的淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞可通过肾小球毛细血管内皮细胞的损伤处,向肾间质浸润,共同加重了肾脏炎症的发生。炎症对肾脏的破坏作用必然导致成纤维细胞的活化,从而分泌大量的胶原纤维对损伤处进行修复,当胶原纤维的产生量大于降解,产生和降解失去平衡的时候,大量的胶原纤维沉积在肾间质,导致肾纤维化的发生。目前,对于炎症反应在肾纤维化的发生、发展中作用已经达成以下共识：①肾脏在各种损伤刺激因素作用下,炎症反应是早期发生的事件,炎症反应的持续发生,最终导致肾纤维化的发生；②炎症细胞的浸润在肾脏纤维化的发生中起着重要的作用；③在肾纤维化的发生过程,炎症趋化因子和炎症因子在炎症细胞的浸润和慢性炎症持续发生过程中起着关键因素。肾纤维化的发生目前一般划分为三个阶段：①诱导期：此期有大量的炎症趋化因子和细胞因子的产生和释放,肾脏组织学表现主要是单核／巨噬细胞和T淋巴细胞等炎症细胞的浸润和活化,同时肾间质内的肌成纤维细胞被激活并增殖；②肾小球系膜细胞产生大量的细胞外基质(ECM)；③ECM被降解,当出现ECM的合成和降解失衡时,肾脏纤维化便不可避免的发生。有研究表明,移植肾间质慢性炎症反应在CRAD的发生、发展过程中起着的重要作用,慢性炎症反应的发生是导致肾单位进行性丢失的共同的病理过程[2]。在形态学上,CRAD主要表现为炎症细胞在肾间质及肾小管的不同程度浸润,从而导致细胞外基质(ECM)的产生,引起移植肾间质纤维化的发生；炎症细胞浸润后相关致纤维化因子的产生,如TIMP-1、PAI-1、PDGF及TGF-β等,这些纤维化因子共同作用于移植肾,最终导致肾纤维化。相关研究表明,单核巨噬细胞的浸润数量与肾纤维化程度成正相关,通过抑制编码巨噬细胞生成的基因或者敲除巨噬细胞基因,发现肾脏纤维化的程度能得到明显减轻[3]。在炎症性肾脏疾病中,包括CRAD, NF-κB的活化是一个重要的细胞信号事件,它控制着一系列炎症介质的转录。目前,已经有大量研究表明GSK-3β是NF-κB活化必不可少的要素[4,5]。GSK-3β是真核细胞生物体内普遍存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它不仅调节细胞糖代谢,更重要的是能够调节细胞分化、生长、突变以及凋亡等生命活动,并且在多种信号传导过程中也起着重要的作用,当GSK-3β (Ser9)磷酸化为pGSK-3β(Ser9)时失活。Gong等[6]在对CRAD的研究中证实,GSK-3β在CRAD的炎症反应发生和调节促炎症介质NF-K B的活化过程中起着重要的作用。GSK-3β不但能够调节NF-κB的活化,而且是NF-κB活化必不可少的要素[7]。可见,肾间质纤维化是多种细胞、细胞因子、炎性介质等诸多因子相互作用,导致ECM代谢失衡,在肾间质异常沉所致,是一个非常复杂的过程,至今移植肾纤维化的发生、发展的关键步骤和确切发病机制尚未得到完全的阐明。本研究主要通过免疫组化方法对ABMR导致CRAD的移植肾组织中GSK-3β、NF-κB的表达进行检测,并分析它们与IF/TA分级的关系,探讨它们在ABMR引起的CRAD发病机制中的作用,为移植肾慢性纤维化的发生和治疗提供一定理论依据。研究目的：探讨GSK-3β、NF-κB和相关炎症性细胞因子在抗体介导的移植肾慢性排斥反应的移植肾组织中的表达情况,并分析其与肾间质纤维化/小管萎缩(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)的发生的关系。探讨它们在BMR引起的CRAD发病机制中的作用,为移植肾慢性纤维化的发生和治疗提供一定的理论依据。研究方法： 1.病例入选标准肾移植术3个月后,不明原因的血肌清酐异常升高130μmol/L;肌酐升高后,给予甲泼尼龙500mg/L连续3天冲击治疗,肌酐无明显降低者,排除急性排斥反应,同时予以ACEI类药物降压及活血护肾等处理,复查均未见好转；彩超检查排除了输尿管梗阻(结石、肿瘤及外源性压迫等)及移植肾动脉狭窄；钙调神经蛋白酶抑制剂(环孢素、他克莫司)浓度维持在正常范围内；T淋巴细胞亚群检测未见明显升高；移植肾病理检查见移植肾间质呈慢性改变,如：肾小管周围毛细血管基底膜增厚、肾小球基底膜增厚(可见假双轨征)；间质纤维化/小管萎缩；动脉内膜增厚。 2.临床资料收集桂林解放军第181医院2002年01月至2013年04月住院的肾移植病人116例,其中尸体供肾98例,活体供肾8例,供受者肾移植术前均行乙肝、丙肝标志物检查为阴性,且术后复查亦均为阴性。术后出现肌酐爬行升高,蛋白尿,且反复定性检查呈阳性(++～++++),定量检查均≥0.20g/24h,予以ACEI类降压、活血护肾等处理,复查均未好转。行移植肾穿刺病理活检术,按照Banff2009移植肾病理分级诊断标准[8],病理诊断为抗体介导的移植肾慢性排斥反应,包括65例男性,(48±11)岁；51例女性,(42±8)岁,肾穿时间为肾移植术后0.3～13.6年,血肌酐(563±137) μmol/l。其中,58例接受环孢素+吗替麦考酚酯+泼尼松三联免疫抑制治疗方案,58例接受他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松三联方案治疗。所有供、受者血型相同,抗供者特异性抗体(DSA)检测阴性,群体反应性抗体(PRA)10%,淋巴细胞毒交叉配型试验(CDC)10%, HLA-A、 HLA-B、HLA-Dr位点至少有二个位点相配。以10例正常肾组织零点穿刺标本作为对照组,病理检查无异常,年龄19-53岁。 3.研究方法用免疫组织化学En Vision二步法检测移植肾组织中GSK-3β是NF-κB、 MCP-1、RANTES的表达,采用德国Leica (DMR+Q550型)真彩色病理图像分析系统对染色结果进行半定量分析,随机选取10个不连续(避开肾小球和大血管)的肾小管间质视野(×400,HPF),每例肾小管总数大于60个。使用ImagePro-Plus6.0软件计算平均光密度,取其均值表示该种成分在肾小管和间质的相对含量。 4.诊断及分类标准依据Banff2009移植肾病理分级诊断标准[8],将移植肾间质纤维化/小管萎缩(IF/TA)的严重程度分为：Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩(25%的皮质受累)；Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩(26%-50%的皮质受累)；Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩(50%的皮质受累)。 ABMR诊断标准[8]:C4d阳性,循环中存在抗供者抗体(DSA),慢性组织损伤的形态学证据,如肾小球基底膜(GBM)双轨征和(或)小管周围毛细血管基底膜多层和(或)间质纤维化/小管萎缩和(或)动脉纤维性内膜增厚。肾小管间质炎症细胞浸润程度分度：轻度少量散在炎症细胞浸润；中度炎症细胞呈局灶性浸润；重度大片、弥漫性炎症细胞浸润。统计分析：数据均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析,计量资料采用one way ANOVA,两两比较用LSD法(t检验)；两变量相关性分析采用Spearman等级相关分析；不同治疗方案中的差异比较用独立样本t检验,P0.05有统计学意义。结果： 1.组织学观察 HE染色下移植肾组织学改变主要表现：小球系膜基质增宽,间质有灶性单核细胞浸润；PASM染色可见：系膜细胞及基质中-重度增生,局部包曼氏囊壁增厚、分层,基底膜增厚,基底膜呈连环样改变和假双轨征；Masson染色组织学表现为：小球呈节段硬化,包蔓氏囊增厚、分层,间质中度纤维化伴有炎症细胞浸润,小管上皮萎缩。不符合急性排斥反应、免疫抑制剂慢性肾毒性损伤、慢性肾小球肾炎等其他肾病病理改变。 2.C4d的表达正常肾组织中C4d主要表达于的肾小球、肾小管基底膜及系膜区,而在正常肾组织肾小管周围毛细血管(PTC)的内皮细胞中未发现C4d沉积；在ABMR移植肾组织标本中,C4d呈阳性表达,主要表达于PTC的内皮细胞((?)50%)。 3. GSK-3β的表达在正常肾组织中,GSK-3β表达较低或无。在ABMR患者移植肾组织中,GSK-3β的表达显著增加,主要表达于肾小管细胞胞浆中。随着GSK-3β平均光密度的增加IF/TA分级、NF-κB p65、RANTES和MCP-1平均光密度亦增大,呈正相关,表示其表达水平亦随之增加。GSK-3β的表达同炎症细胞浸润亦具有正相关性。 4. NF-κB p65的表达正常肾组织中可在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞偶见NF-κB p65表达。在ABMR患者移植肾组织中,NF-κB p65主要表达在包曼氏囊上皮细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞,表达水平较对照组明显增加,其表达水平同炎症性细胞因子RANTES、MCP-1及IF/TA病理分级呈正相关；NF-κB p65的表达同炎症细胞浸润亦具有正相关性。 5. RANTES的表达正常肾组织中的RANTES表达量低或无。在ABMR患者移植肾组织中RANTES大量表达于肾小管上皮细胞、肾小球系膜区及肾间质内的单核巨噬细胞,血管内皮细胞亦可见RANTES阳性细胞。肾小管损伤愈严重、间质炎症细胞浸润愈多的部位,表达愈强。并且RANTES的表达随着间质纤维化/小管萎缩的程度加重而增多,具有正相关性；RANTES的表达同炎症细胞浸润亦具有正相关性。 6.MCP-1在肾组织中的表达和血清肌酐水平正常肾组织中MCP-1表达较少。而在ABMR患者移植肾组织中,MCP-1表达显著增加,主要位于肾小管上皮细胞胞浆、肾小球系膜区及毛细血管袢内皮侧,MCP-1与IF/TA病理分级亦呈正相关。ABMR患者血清肌酐升高的水平同纤维化程度分级的增加一致；MCP-1的表达同炎症细胞浸润亦具有正相关性。 7. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在不同免疫抑制方案组间的表达情况在环孢素和他克莫司两种为主的免疫抑制剂方案组之间GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表达无均无明显统计学差异。 8. ABMR患者移植肾组织中GSK-3β的表达同NF-κBp65、RANTES和MCP-1的关系在正常肾组织中,GSK-3β表达较低或无。在ABMR患者移植肾组织中,GSK-3β的表达显著增加,主要表达于肾小管细胞胞浆中。随着GSK-3β平均光密度的增加NF-κB p65、RANTES和MCP-1平均光密度亦增大,呈正相关(r分别为0.812、0.804和0.788, P0.001)。 9. GSK-3β、NF-κBp65、RANTES和MCP-1的表达同肾间质炎症细胞浸润的关系随着移植肾间质中GSK-3β、NF-κkB p65、RANTES和MCP-1的表达表达水平的增加,间质中炎症细胞浸润程度也加重,两者呈正相关(r分别为0.905、0.868、0.931和0.897,P0.001)。 10. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表达同IF/TA病理分级的关系随着间质纤维化/小管萎缩的程度加重,GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表达亦随之而增多,具有正相关性(r分别为0.884、0.914、0.888和0.868,P0.001)。 11. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在不同免疫抑制方案组间的表达情况在环孢素和他克莫司两种为主的免疫抑制剂方案组之间GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表达无均无明显统计学差异(P分别为：0.137、0.197、0.578、0.140)。结论： 1.在抗体介导的慢性排斥反应患者移植肾组织中,移植肾病理组织学改变主要为：小球系膜基质增宽,间质有灶性单核细胞浸润；PASM染色可见：系膜细胞及基质中-重度增生,局部包曼氏囊壁增厚、分层,基底膜增厚,基底膜呈连环样改变和假双轨征；Masson染色组织学表现为：小球呈节段硬化,包蔓氏囊增厚、分层,间质中度纤维化伴有炎症细胞浸润,小管上皮萎缩。不符合急性排斥反应、免疫抑制剂慢性肾毒性损伤、慢性肾小球肾炎等其他肾病病理改变。 2. GSK-3β的表达同NF-κBp65、 RANTES和MCP-1的表达呈现正相关性。 3. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在ABMR患者移植肾组织中的表达较正常组显著升高,并且随着IF/TA分级的增加呈现出逐渐增多。 4. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在ABMR移植肾组织中的表达随着间质中炎症细胞浸润的增多表达而增加。 5. GSK-3β和NF-κB p65的表达异常增高同移植肾间质纤维化/小管萎缩、慢性移植肾失功的发生、发展有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R699.2

【参考文献】