二甲双胍对糖尿病肾脏疾病的保护作用及机制探讨

发布时间：2018-09-19 08:54

【摘要】：目的通过观察早期糖尿病肾脏疾病(Diabetic kidney disease,DKD)患者尿白蛋白排泄(Urinary albumin excretion,UAE)、尿液中丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量、晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性,和二甲双胍(Metformin)治疗后上述指标的的变化,以及尿液MDA和AOPPs含量、SOD和CAT活性的变化与尿白蛋白排泄的变化之间的关系,探讨二甲双胍对糖尿病肾脏疾病的保护作用及机制。方法:选择2012年01月—2013年12月于我院体检中心健康成人54例及门诊和住院的2型糖尿病(WHO标准,1999)同时伴有早期DKD(诊断标准UAER 20~200ug/min)的患者120例,随机分组如下:①正常对照组:健康志愿者②二甲双胍组(MET):二甲双胍干预;③阿卡波糖组(ACA):阿卡波糖干预;二甲双胍组与阿卡波糖组均予糖尿病健康教育、合理饮食及适量运动干预,分别于治疗前及治疗后第1、3、6个月收集患者尿液及血液。观察二甲双胍组与阿卡波糖组患者治疗前后体重指数(BMI)变化,水银血压计测量收缩压(Systolic blood pressure,SBP)及舒张压(Diastolic blood pressure,DBP),全自动生化分析仪检测空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、餐后2h血糖(2h-Postprandial plasma glucose,2hPG)、血低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(Triglyceride,TG),采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿MDA(UMDA)与AOPPs(UAOPPs)含量、尿SOD(USOD)与CAT(UCAT)活性、高效液相色谱法测定糖化血红蛋白(hba1c)、免疫比浊法检测尿白蛋白、肌氨酸氧化酶法检测尿肌酐(ucr)、化学发光免疫分析法测定空腹血胰岛素(fastingseruminsulin,fins)。采用葡萄糖自身稳定数学模型评价法计算胰岛素抵抗指数(homa公式:iri=fbg×fins/22.5)。结果1.各组fpg、2hpg、hba1c、bmi、fins、iri的比较与正常对照组相比,治疗前二甲双胍组与阿卡波糖组患者fpg、2hpg和hba1c均有明显升高(p0.05)。较治疗前相比,治疗后第1个月两组患者fpg、2hpg均有明显下降(p0.05),hba1c无明显下降(p0.05)。治疗后第3、6个月两组患者fpg、2hpg和hba1c均有明显下降(p0.05),但两组间差异无统计学意义(p0.05)。较治疗前相比,二甲双胍组治疗后第1、3、6个月bmi、fins、iri明显下降(p0.05),而阿卡波糖组治疗后bmi、fins无明显下降(p0.05),iri明显下降(p0.05),两组间差异明显(p0.05)。2.各组tg、ldl-c、sbp、dbp的比较与正常对照组相比,治疗前二甲双胍组与阿卡波糖组患者tg、ldl-c、sbp和dbp均有明显升高(p0.05)。较治疗前相比,二甲双胍组与阿卡波糖组患者治疗后第1、3、6个月tg、ldl-c、sbp、dbp均无明显下降(p0.05)。3.各组患者umda/ucr、uaopps/ucr,usod/ucr、ucat/ucr的比较与正常对照组相比,治疗前二甲双胍组与阿卡波糖组患者umda/ucr、uaopps/ucr升高,usod/ucr、ucat/ucr降低(p0.05)。与治疗前相比,治疗后第1、3、6个月二甲双胍组患者umda/ucr、uaopps/ucr明显降低、usod/ucr、ucat/ucr均有明显升高(p0.05)。而阿卡波糖组治疗后患者umda/ucr、uaopps/ucr,usod/ucr和ucat/ucr无明显改变(p0.05),两组间差异明显(p0.05)。4.各组患者uae/ucr(uacr)的比较与正常对照组相比,治疗前二甲双胍组与阿卡波糖组患者uacr均有升高(p0.05)。与治疗前相比,治疗后第1、3、6个月二甲双胍组患者uacr下降(p0.05),阿卡波糖组治疗后患者UACR无明显下降(P0.05),两组间差异明显(P0.05)。5.UACR和UMDA/UCr相关性分析二甲双胍组治疗前后UACR和UMDA/UCr呈正相关(r=0.834,P0.05)6.UACR和UAOPPs/UCr相关性分析二甲双胍组治疗前后UACR和UAOPPs/UCr呈正相关(r=0.821,P0.05)7.UACR和USOD/UCr相关性分析二甲双胍组治疗前后UACR和USOD/UCr呈负相关(r=-0.867,P0.05)8.UACR和UCAT/UCr相关性分析二甲双胍组治疗前后UACR和UCAT/UCr呈负相关(r=-0.877,P0.05)结论2型糖尿病患者尿液中MDA、AOPPs和尿白蛋白排泄增加,SOD、CAT活性减低;二甲双胍可减少尿MDA、AOPPs和白蛋白排泄,并升高SOD、CAT活性,上述作用可能是其肾脏保护的部分机制。目的通过观察体外高浓度葡萄糖培养的大鼠肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生、P22phoxm RNA及蛋白表达、丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)蛋白磷酸化表达和细胞培养上清液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPP)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性,以及二甲双胍(Metformin,MET)干预后的效应,探讨二甲双胍对MCs氧化应激的影响及机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分组如下:①NC组(正常对照组):低糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L);②HG组(高浓度葡萄糖培养组):高糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为30mmol/L);③MET组(二甲双胍干预组):高糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为30mmol/L)加入二甲双胍(5mmol/L)干预;④SB组(SB203580干预组,SB203580-p38MAPK抑制剂):高糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为30mmol/L)加入SB203580(10umol/L)干预;⑤NAC组(N-乙酰-L-半胱氨酸干预组,NAC-抗氧化剂):高糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为30mmol/L)加入N-乙酰-L-半胱氨酸(100umol/L)干预.以上各组培养48小时后收集大鼠肾小球系膜细胞及培养上清液。以2',7'-二氯双氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)为荧光探针,采用流式细胞仪检测大鼠肾小球系膜细胞内ROS水平。以实时定量PCR法(Real-time quantitative polymerase chainreaction,QPCR)检测大鼠肾小球系膜细胞NADPH氧化酶跨膜亚基P22phoxm RNA表达,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。Western blot法检测P22phox蛋白表达及p38MAPK蛋白磷酸化表达。结果1.各组大鼠肾小球系膜细胞内ROS产生的比较1.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内ROS产生的影响与NC组(0.7±0.2)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞内ROS水平明显增加为19.4±2.5,差异显著(P0.05)。1.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞内ROS产生的影响与HG组(19.4±2.5)相比,MET组细胞内ROS水平明显下降至7.2±1.4;SB组细胞内ROS水平明显下降为12.8±1.8;NAC组细胞内ROS水平明显下降为4.2±0.9,差异均显著(P0.05)。2.各组大鼠肾小球系膜细胞P22phox m RNA表达的比较2.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞P22phox m RNA表达的影响与NC组(1±0)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞P22phox m RNA表达水平增加为4.5±0.7,差异显著(P0.05)。2.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞P22phox m RNA表达的影响与HG组(4.5±0.7)相比,MET组细胞P22phox m RNA的表达水平下降为3.5±0.5;SB组细胞P22phox m RNA的表达水平下降为3.6±0.5;NAC组细胞P22phox m RNA的表达水平下降为3.0±0.4,差异均显著(P0.05)。3.各组大鼠肾小球系膜细胞P22phox蛋白表达的比较3.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞P22phox蛋白表达的影响与NC组(0.24±0.1)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞P22phox蛋白表达水平增加为0.64±0.2,差异显著(P0.05)。3.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞P22phox蛋白表达的影响与HG组(0.64±0.2)相比,MET组细胞P22phox蛋白的表达水平下降为0.36±0.1;SB组细胞P22phox蛋白的表达水平下降为0.46±0.1;NAC组细胞P22phox蛋白的表达水平下降为0.33±0.1,差异均显著(P0.05)。4.各组大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达的比较4.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达的影响与NC组(0.14±0.04)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达水平增加为0.54±0.2,差异显著(P0.05)。4.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达的影响与HG组(0.54±0.2)相比,MET组细胞p38MAPK蛋白磷酸化的表达水平下降为0.39±0.1;SB组细胞p38MAPK蛋白磷酸化的表达水平下降为0.26±0.1;NAC组细胞p38MAPK蛋白磷酸化的表达水平下降为0.43±0.1,差异均显著(P0.05)。5.各组大鼠肾小球系膜细胞上清液中丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)含量的比较5.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞上清液中MDA、AOPPs产生的影响与NC组(627.2±62.9)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞上清液中MDA含量增加为846.8±87.2,差异显著(P0.05)。与NC组(557.6±94.7)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞上清液中AOPPs含量明显增加为851.4±127.3,差异显著(P0.05)。5.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞上清液中MDA、AOPP含量的影响与HG组(846.8±87.2)相比,MET组细胞上清液中MDA含量下降为733.2±71.3;SB组细胞上清液中MDA含量下降为770.4±76.0;NAC组细胞上清液中MDA含量下降为720.2±69.1,差异均显著(P0.05)。与HG组(851.4±127.3)相比,MET组细胞上清液中AOPP含量下降为649.8±109.8;SB组细胞上清液中AOPP含量下降为695.6±112.9;NAC组细胞上清液中AOPP含量下降为598.6±103.4,差异均显著(P0.05)。6.各组大鼠肾小球系膜细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性的比较6.1高浓度葡萄糖培养对大鼠肾小球系膜细胞上清液中SOD、CAT活性的影响与NC组(171.8±42.6)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞上清液中SOD活性下降为130.2±28.4,差异显著(P0.05)。与NC组(34.4±8.1)相比,高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞48h后,细胞上清液中CAT活性下降为14.0±3.5,差异显著(P0.05)。6.2二甲双胍、SB203580及NAC对高浓度葡萄糖培养大鼠肾小球系膜细胞上清液中SOD、CAT活性的影响与HG组(130.2±28.4)相比,MET组细胞上清液中SOD活性增加为145.4±33.5;SB组细胞上清液中SOD活性增加为149.4±34.3;NAC组细胞上清液中SOD活性增加为151.6±36.5,差异均显著(P0.05)。与HG组(14.0±3.5)相比,MET组细胞上清液中CAT活性增加为25.4±5.8;SB组细胞上清液中CAT活性增加为21.0±5.1;NAC组细胞上清液中CAT活性增加为26.6±6.3,差异均显著(P0.05)。7.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和细胞内ROS水平变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和细胞内ROS水平变化呈正相关(r=0.770,P0.05)。8.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中MDA含量变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中MDA含量变化呈正相关(r=0.909,P0.05)。9.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中AOPPS含量变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中AOPPs含量变化呈正相关(r=0.941,P0.05)。10.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中SOD活性变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中SOD活性变化呈负相关(r=-0.882,P0.05)。11.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中CAT活性变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和上清液中CAT活性变化呈负相关(r=-0.890,P0.05)。12.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和P22phox蛋白表达变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和P22phox蛋白表达变化呈正相关(r=0.858,P0.05)。13.肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和P22phox m RNA表达变化相关性分析二甲双胍治疗前后大鼠肾小球系膜细胞p38MAPK蛋白磷酸化表达变化和P22phox m RNA表达变化呈正相关(r=0.875,P0.05)。结论(1)高浓度葡萄糖诱导大鼠肾小球系膜细胞内ROS产生增多、P22phox m RNA及蛋白表达、p38MAPK蛋白磷酸化表达增加、细胞培养上清液中丙二醛、晚期氧化蛋白产物含量增多,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性减低(2)二甲双胍可抑制高浓度葡萄糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞内氧化应激,其机制可能部分与其抑制P22phoxm RNA及蛋白过表达和p38MAPK蛋白磷酸化有关,该作用可能是其肾脏保护的机制之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】