【摘要】：背景：膀胱癌是泌尿生殖系统中的常见肿瘤,其中90%的组织学类型为膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)。尽管经过了多年的深入研究和探索,但BUC发生发展的分子生物学机制仍不十分明朗。目前针对BUC的各种治疗手段仍不能让人完全满意,BUC患者的总体预后仍不容乐观。因此,深入研究探索BUC发生发展相关的分子生物学机制对于提高BUC的诊疗水平和改善BUC患者的预后具有十分重大的价值。 高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1)是一种在真核生物的细胞中广泛表达且高度保守的非组蛋白核蛋白。近年来研究发现,HMGB1与肿瘤的无限增殖,抵抗凋亡,新生血管生成,浸润转移等生物学行为密切相关,在肿瘤的发生发展中起到了重要的作用。但目前国内外对于HMGB1在BUC中的表达研究较少,其对BUC生物学行为的影响及其在BUC发生发展中所起的作用还不清楚。 目的：(1)研究HMGB1在BUC组织及细胞株中的表达情况,分析HMGB1的表达和BUC临床病理因素之间的关系。(2)探索构建靶向HMGB1的短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)表达载体并转染人BUC细胞株T24来特异性的沉默HMGB1基因的表达。(3)研究shRNA介导的RNA干扰对T24细胞HMGB1表达的影响及T24细胞生物学活性的变化。(4)初步研究HMGB1影响人BUC细胞生物学行为可能的下游作用机制。 方法：(1)收集30例BUC组织及其配对的癌旁组织,采用Western-blot和实时荧光定量-PCR(real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)分析BUC组织和细胞中HMGB1的表达水平,同时采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测HMGB1蛋白的表达程度和定位,分析其表达水平和BUC临床病理因素之间的关系。(2)探索构建靶向HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体并采用脂质体lipofectamineTM2000转染T24细胞来特异性的沉默HMGB1的表达,采用Western-blot和Real-time PCR检测shRNA干扰序列对HMGB1表达的影响。(3)采用MTT法、流式细胞术、Transwell实验研究pGPU6/GFP/Neo-HMGB1shRNA-539表达载体转染的T24细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和细胞周期的变化。(4)采用Western-blot和Real-time PCR检测HMGB1干扰序列转染T24细胞后核转录因子-κB (nuclear factor kappa B/p65, NF-κB/p65)和血管内皮细胞生长因子-C (vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表达水平,同时采用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)来分别检测NF-κB/p65在细胞内的定位情况和活性变化。 结果：(1) HMGB1在BUC组织中高表达,其表达水平显著高于配对的癌旁组织；IHC结果显示HMGB1的阳性染色颗粒绝大部分位于细胞核,少部分位于细胞浆；结合患者的临床病理资料进行分析发现HMGB1的表达水平与患者的组织学分级和TNM分期呈正相关；同时,HMGB1在5637、BIU-87和T24细胞中的表达水平逐次升高,与BUC细胞的恶性程度相关。(2)实验成功的构建了特异性干扰HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体并成功转染T24细胞；经检测3条shRNA均可以特异性的抑制HMGB1的表达,其中以HMGB1shRNA-539抑制效率最高。(3)特异性的干扰HMGB1基因的表达能在体外抑制T24细胞增殖、迁移、侵袭能力并诱导细胞周期G0/G1期迟滞和细胞凋亡。(4) HMGB1干扰序列转染T24细胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表达水平下调；同时NF-κB/p65的核转位减少活性降低。 结论：(1) HMGB1的表达水平在BUC组织和细胞中明显增高,且与BUC的组织学分级和TNM分期正相关,HMGB1可能与BUC的发生发展密切相关。(2)特异性的下调T24细胞HMGB1的表达可以显著抑制其增殖、迁移、侵袭能力并诱导细胞周期G0/G1期迟滞和细胞凋亡,HMGB1可以作为BUC基因治疗的一个潜在靶点。(3)特异性的下调T24细胞HMGB1基因的表达可以引起细胞中NF-κB/p65和VEGF-C的表达下调,进而抑制NF-κB/p65的活性和核转位,提示HMGB1对VEGF-C的调节可能是由NF-κB通路来实现的。图25幅,表35个,参考文献135篇。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.14
【参考文献】
相关期刊论文 前9条
1 黄庆先,王国斌,孙念峰,王春友;高迁移率族蛋白框1反义核酸抑制人胰腺癌细胞系PCNA-1侵袭的研究[J];癌症;2004年09期
2 刘懿;张鹏;吴志浩;陈军;周清华;;高表达HMGB1肺癌细胞系的筛选及意义[J];中国肺癌杂志;2009年09期
3 宋舟;刘屹;包国强;何显力;马庆久;;HMGB1在大肠癌组织中的表达及其意义[J];现代肿瘤医学;2008年07期
4 张明星;尹丽霞;窦中岭;史海军;王晓彬;刘辉;;HMGB1和MMP2在肾透明细胞癌中的表达及意义[J];现代泌尿生殖肿瘤杂志;2012年04期
5 ;VEGF、VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达增加与前列腺癌进展期的相关性研究(英文)[J];Asian Journal of Andrology;2006年02期
6 ;Growth suppression and radiosensitivity increase by HMGB1 in breast cancer[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年12期
7 康睿;唐道林;曹励之;俞燕;张国元;肖献忠;;急性淋巴细胞性白血病患儿血清高迁移率族蛋白1检测及其诱导白血病细胞分泌肿瘤坏死因子α的实验研究[J];中华儿科杂志;2007年05期
8 V銉lp K.;Brezniceanu M.-L.;B銉sser S.;M. Z銉rnig;刘丽娜;;人结肠癌HMGB1基因表达增加与抗凋亡蛋白c-IAP2水平增高的相关性[J];世界核心医学期刊文摘(胃肠病学分册);2006年Z1期
9 来雷;杨林军;翟昌林;;RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J];中国现代医生;2012年24期
相关博士学位论文 前1条
1 陈若蝉;HMGB1在不同转移潜能人肝癌细胞系中的表达及潜在作用[D];中南大学;2012年
，
本文编号：
2278173
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/mjlw/2278173.html
