膀胱平滑肌自噬在IC和环磷酰胺诱导大鼠膀胱炎中的作用及意义

发布时间：2018-11-15 10:00

【摘要】：研究目的和背景 大自噬(简称为“自噬”)是细胞进化进程中的重要保守过程，其通过隔离细胞内的细胞器、蛋白质聚物等，并将这些细胞代谢垃圾输送到溶酶体降解，其在细胞中扮演着管家的功能维持着细胞生物功能的质量和数量。目前，大量研究表明自噬调控途径和/或自噬相关蛋白质在调节和控制免疫反应以及炎症中发挥着至关重要的作用。自噬紊乱参与了人体多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病机制和病理进展，如：Crohn氏病，囊性纤维化肺疾病，糖尿病，肝脏疾病和肠道炎症等。 膀胱疼痛综合症/间质膀胱炎(BPS/IC)是泌尿科处理棘手膀胱炎症疾病，其特点为尿频、尿急、盆腔疼痛以及泌尿道其他不适。迄今为止，对于BPS/IC的病理生理尚未阐明，目前存在多种学说如：感染、自身免疫、尿液毒性物、膀胱上皮障碍以及神经炎症等。但炎症和免疫紊乱在起发病机制中起着关键作用。 血管、气道、阴茎等组织平滑肌细胞自噬目前已经被证实存在，并且自噬在其中扮演这重要的保护功能和作用。然而，膀胱平滑肌细胞是否存在自噬以及其介导自噬是否参与了BPS/IC的病理生理目前尚未见报道。环磷酰胺(CYP)是一种有效的抗肿瘤性疾病的化疗药物，已被广泛的运用于抗肿瘤治疗中，丙烯醛是其毒性代谢物，该物质能诱发啮齿类动物膀胱炎症反应，因此其已被广泛用来研究炎症和免疫紊乱在膀胱炎症疾病中作用和意义(包括BPS/IC)。据此，本研究旨在探讨膀胱逼尿肌肌细胞是否存在自噬以及自噬在BPS/IC和环磷酰胺诱发膀胱炎动物模型中的功能和作用。 方法： 在第一部分中，我们主要目的为讨探自噬是否存在人类和大鼠逼尿肌肌细胞。首先，搜集人类和大鼠的膀胱组织。其次，透射电子显微镜(TEM)和双标记免疫荧光分别检测人和大鼠逼尿肌肌细胞自噬小体和LC3和α-SMCA的共定位。三，免疫印迹和RT-PCR方法证实LC3蛋白和基因的表达。 在第二部分中，我们探索了人对照组膀胱和BPS/IC膀胱之间的自噬的变化以及膀胱组织学变化。首先，搜集病人膀胱组织。第二，透射电子显微镜(TEM)和双标记免疫荧光法分别用于检测逼尿肌肌细胞自噬和LC3的荧光斑点的变化。第三，蛋白印迹法确认LC3蛋白的表达。第四，HE和甲苯胺蓝染色法用于组织学评分和肥大细胞计数。 在第三部分中，我们研究了逼尿肌肌细胞自噬在环磷酰胺诱发膀胱炎动物模型的功效。首先，动物组分类和动物模型建立。第二，透射电子显微镜(TEM)和双标记免疫荧光法分别用于检测逼尿肌肌细胞自噬体和在每个组的LC3荧光斑点的变化。第三，蛋白印迹法确认LC3、P-P70S6K和SOD2蛋白在各组的表达。第四，HE和甲苯胺蓝染色法用于每一个组组织学评分和肥大细胞计数。第五， ELISA法测定IL-1β、IL-6， IL-8，MDA和GSH在各组的表达。六，尿动力学用于评估各组大鼠膀胱功能改变情况。 结果 1.通过电镜，免疫印迹， RT-PCR和免疫荧光双标记等我们证实逼尿肌肌细胞存在自噬小体和自噬相关的标志物蛋白和基因LC3. 2.与对照组病人膀胱组织相比，IC病人的膀胱组织上皮明显变薄、水肿，大量炎性细胞浸润固有层和肌肉层。此外，定量评价表明浸润到肌肉层的肥大细胞数相对于对照组显著增加。运用电子显微镜，免疫荧光双标记和免疫印迹技术，我们发现于对照组相比，逼尿肌肌细胞自噬在IC患者中显著增加，但其清除细胞受损的细胞器功能明显降低，通过电镜我们发现在IC患者逼尿肌细胞中，受伤的细胞器，包括线粒体并没有被自噬体所包裹。 3.在环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎中，逼尿肌细胞自噬的激活通过LC3斑点表达和P70S6K蛋白表达增加以及自噬体数目增加而证实。在环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎中，逼尿逼细胞自噬激活的不充分，导致了炎症和氧化应激增强以及膀胱出现过度的活动。在使用自噬激动剂雷帕霉素预处理过的环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎中，炎症和氧化应激反应显著降低，膀胱组织学和尿动力学功能得到显著改善。与此相反，，使用自噬拮抗剂氯喹预处理过的环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎中，炎症和氧化应激显着增加，膀胱组织学和膀胱功能严重受伤。 结论 1.我们通过电镜、免疫荧光、western blot优先证实了人和大鼠膀胱平滑肌细胞存在自噬 2.于对照组人膀胱组织标本相比，我们发现BPS/IC病人膀胱平滑肌自噬显著增加，但其功能并未增加。在电镜下我们发现，BPS/IC病人膀胱平滑肌细胞胞中存在较多损伤的线粒体和细胞器，然而自噬小体却未能吞噬和包裹这些损伤的细胞亚结构，这提示在PBS/IC病人中自噬是紊乱，这可能也是PBS/IC病人膀胱炎症持续的重要原因。 3.我们的实验证明了大鼠膀胱平滑肌细胞存在自噬，通过雷帕霉素增强大鼠平滑肌细胞自噬能显著的降低炎症和氧化应激并改善膀胱功能。这提示已在临床使用的雷帕霉素可能是一个有效的治疗BPS/IC的药物。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R694.3


本文编号：2332976