miR-106b-5p靶向调控SETD2基因对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响及机制研究

发布时间：2018-11-15 18:17

【摘要】：以肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)为代表的肾细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,由于其对放化疗及生物免疫治疗缺乏敏感,故成为肾癌术后复发、转移等晚期病人预后差的关键因素。深入研究肾透明细胞癌的发病机理,并探寻合适的标靶是当前该病诊断、治疗及预后的潜在方向。在肾透明细胞癌中,SETD2基因是仅次于VHL和PBRM1的第三大抑癌基因,而有关它的表达缺失或下调机制,目前尚不明晰。微小RNA (miRNA)是一类短链非编码RNA,通过在转录后水平负性调控靶基因,下调靶基因表达并影响其所在的信号通路传导,从而在生物体生命活动尤其是肿瘤发生、进展中扮演重要角色。结合生物信息学及相关的预测软件,我们发现miRNA与SETD2存在潜在的关联性,即SETD2基因的表达缺失或下调可能源于某一或某些miRNAs的负性调控。因此,本研究旨在从miRNA介导的转录后调控方面着手探索SETD2表达缺失或下调的机制,以阐明SETD2及相关miRNAs对ccRCC细胞生物学行为的影响,为未来的临床诊治提供理论依据。我们将通过检测SETD2基因及各预测候选miRNAs在人ccRCC中的表达水平,揭示它们在ccRCC临床诊断与治疗中的潜在意义；通过体外实验,探索并验证ccRCC中靶向调控SETD2的miRNAs;研究miRNA调控SETD2对ccRCC细胞生物学行为的影响,并探索其潜在的作用机制。本研究分为以下三个部分： 第一部分SETD2基因及各预测miRNAs在人肾透明细胞癌中的表达研究 目的：检测人正常肾组织与肾透明细胞癌(ccRCC)组织及细胞中SETD2基因、各预测miRNAs的表达差异,筛选与SETD2潜在关联的miRNA(s)。 方法：采用实时定量PCR(qPCR)和western blot法分别检测40例临床组织标本及细胞系中SETD2基因的mRNA水平和蛋白表达量,并分析其表达差异。随机选取30例配对ccRCC组织与正常肾组织,采用免疫组织化学染色法(IHC)检测并分析SETD2蛋白在正常肾与癌组织中的表达差异。应用Target-Scan microRNA.org、miRWalk等多个靶点预测软件逆向筛选可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs,同时结合在线ccRCC的miRNA表达谱数据库,筛选出可能调控SETD2的]miRNAs。采用qPCR检测各预测miRNAs在细胞系及组织标本中的表达水平并比较其差异,同时分析各预测miRNAs与SETD2表达的相关性。 结果：相较正常肾组织,SETD2基因的mRNA在77.50%(31/40)的ccRCC组织中显著下调,而SETD2蛋白表达水平在65.00%(26/40)的ccRCC组织中显著下调。相较HK-2细胞系,786-0和SN12-PM6细胞中的SETD2基因mRNA和蛋白表达均显著下调。免疫组织化学染色分析结果显示SETD2蛋白在正常肾组织中76.67%(23/30)呈强阳性表达,13.33%(4/30)呈弱阳性表达,10.00%(3/30)为低表达；在ccRCC组织中,80.00%(24/30)呈低表达或无表达,16.67%(5/30)呈弱阳性表达,3.33%(1/30)为强阳性表达。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p被筛选作为可能调控SETD2基因的候选miRNAs。相较HK-2细胞系,miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p在786-0和SN12-PM6细胞系中均高表达,而miR-20a-5p表达差异不明显。相较正常肾组织,miR-23b-5p. miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p在ccRCC中显著上调的比例分别为：60.00%(24/40)、55.00%(22/40)、67.50%(27/40)、47.50%(19/40)和35.00%(14/40)。经t检验分析显示在ccRCC组织与正常肾组织中表达有显著差异的miRNAs分别是：miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p。进一步通过相关性分析发现在ccRCC组织中SETD2的mRNA水平与miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表达水平呈显著负相关。 结论：在ccRCC中,SETD2基因是一个重要的抑癌基因,其表达缺失或下调可能与候选miRNAs:miR-23b-5p、miR-34b-3p和miR-106b-5p的异常上调有关。 第二部分在肾透明细胞癌中miR-106b-5p靶向调控SETD2及其机制研究 目的：在miRNA介导的转录后调控水平探索SETD2基因在肾透明细胞癌中表达缺失或下调的机制。 方法：采用化学合成法获得各预测miRNAs的抑制剂anti-miRNAs及模拟物mimics,分别将其转入ccRCC细胞系786-0和SN12-PM6,应用实时荧光定量PCR及western blot法检测SETD2基因mRNA和蛋白的表达变化。构建含SETD2基因3'-UTR野生型和突变型的双荧光素酶报告载体,采用双荧光素酶法进行检测分析以探索候选miRNAs对SETD2的调控方式。设计“逆转”实验,将小干扰RNA si-SETD2与候选miRNA的抑制剂共转入肾癌细胞系,应用qPCR和western blot法分别检测SETD2基因mRNA和蛋白水平的表达变化,进一步探索候选miRNA对SETD2基因可能的调控作用。结果：转入各预测miRNAs的抑制剂后,仅anti-miR-106b-5p使786-0和SN12-PM6细胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表达显著上调。而反过来,向786-0和SN12-PM6细胞系中转入miR-106b-5p的模拟物mimic后,SETD2基因的mRNA和蛋白表达进一步下调。双荧光素酶检测分析结果显示在转入miR-106b-5p的模拟物mimic后,HK-2、786-0和SN12-PM6细胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的荧光素酶活性明显降低,而3’-UTR突变型无显著影响。相反,在转入miR-106b-5p的抑制剂后,786-O和SN12-PM6细胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的荧光素酶活性显著提高,而3’-UTR突变型无明显改变。另外,在“逆转”实验中,转入anti-miR-106b-5p可使786-0和SN12-PM6细胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表达显著上调,而同时转入si-SETD2将逆转anti-miR-106b-5p转入所致的SETD2表达上调作用。 结论：SETD2基因是miR-106b-5p的一个新的靶基因,在肾透明细胞癌中SETD2基因的表达缺失或下调可能是由于miR-106b-5p的过表达所致。 第三部分miR-106b-5p调控SETD2对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响及其机制研究 目的：研究miR-106b-5p调控SETD2对肾透明细胞癌细胞生物学行为的潜在影响,并探索其作用机制。 方法：同前述“逆转”实验,将转染分为5组,即anti-NC+si-NC、anti-miR-106b-5p+si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+si-SETD2,分别转染肾癌细胞系786-O与SN12-PM6,应用流式细胞术检测各转染组细胞周期和凋亡的可能变化,并采用EdU法检测细胞增殖的改变。同时,我们采用qPCR与western blot法分别检测上述各组转染情况下肾癌细胞中p53、caspase3的表达变化。同时提取各转染组细胞的核蛋白,western blot法检测核蛋白H3K36me3可能的表达变化。另外,通过双荧光素酶实验检测miR-106b-5p调控si-SETD2对p53启动子活性可能的影响,并应用ChIP技术探索p53基因启动子与H3K36me3的潜在关系。 结果：流式细胞周期、凋亡检测及EdU细胞增殖实验检测结果显示在786-0与SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p均可使两种肾癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,即G0/G1比例增加,而S期减少,且细胞增殖明显减少,细胞凋亡明显增加,而干扰SETD2表达则促进细胞周期的进展,即G0/G1期减少,S期增多,且细胞增殖明显增加,细胞凋亡明显减少。此外,干扰SETD2的表达可逆转沉默miR-106b-5p所致的细胞周期阻滞、凋亡增加和增殖抑制效应。qPCR结果显示在786-0与SN12-PM6细胞中,沉默miR-106b-5p可使p53基因mRNA明显上调,而干扰SETD2表达一方面使p53mRNA明显下调,另一方面还可逆转沉默miR-106b-5p所致的p53基因mRNA上调效应。各转染组caspase-3基因的mRNA变化无明显改变。Western blot结果显示在沉默miR-106b-5p后,786-0与SN12-PM6细胞中p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白(cleaved caspase-3)的表达显著增加,而前体caspase-3蛋白(procaspase-3)明显下调；相较对照组,干扰SETD2表达可使p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白(cleaved caspase-3)表达下调,而前体caspase3蛋白(procaspase-3)增加；此外,干扰SETD2可逆转沉默miR-106b-5p所致的p53、H3K36me3、cleaved caspase-3三种蛋白上调及procaspase-3蛋白下调。ChIP实验与双荧光素酶实验结果显示在786-O与SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p可使H3K36me3与p53启动子区的相对结合量显著增加,p53启动子载体的萤火虫/海肾荧光素酶活性也明显增加；而干扰SETD2表达则使H3K36me3与p53启动子区的相对结合量显著减少,p53启动子载体的萤火虫/海肾荧光素酶活性亦明显减少；此外,干扰SETD2也逆转了沉默miR-106b-5p所致的H3K36me3与p53启动子区相对结合量增加,及p53启动子萤火虫／海肾荧光素酶活性增加的效应。 结论：miR-106b-5p对肾透明细胞癌细胞的周期、凋亡及增殖的影响依赖于其对SETD2的直接靶向调控,"miR-106b-5p—SETD2—H3K36me3—p53/caspase-3"轴可能参与肾透明细胞癌细胞生物学行为的调控。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11

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本文编号：2334072