慢性肾衰竭FGF23表达调控的影响因素及其作用机制研究

发布时间：2018-12-13 23:11

【摘要】：成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)是慢性肾衰竭-矿物质和骨代谢紊乱(Chronic Kidney Disease Mineral and Bone disorder,CKD-MBD)中最为重要的致病因子。慢性肾衰竭中后期,异常升高的FGF23可介导包括心肌肥厚等不良反应,并与患者的全因死亡率成正相关,成为该类疾病预后不良的标志之一。因此寻找慢性肾衰竭中FGF23异常升高的原因并降低其水平具有极为重要的意义。本研究主要目的是比较接受不同透析方式的患者血清FGF23水平的表达差异,并分析FGF23的相关因素;从体内体外实验研究钙对FGF23的表达是否存在调控作用,并探讨钙促进成骨细胞合成FGF23增多的可能机制,评价干预疗效。该研究将会进一步丰富慢性肾衰竭患者FGF23升高的可能机制,为临床上寻找降低慢性肾衰竭患者血清FGF23水平有效手段提供理论依据。为探究不同透析方式中患者血清FGF23水平表达差异,我们采用自动生化分析仪检测透析患者血磷、血钙、铁蛋白、血红蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、25羟维生素D、透析前后尿素、肌酐,计算透析充分性指标尿素清除指数(Kt/V);采用化学发光仪法检测透析患者全段PTH(intact parathyroid hormone,iPTH)水平。运用ELISA法检测透析患者血清全段FGF23(intact fibroblast growth factor23,iFGF23)。并用多元回归分析FGF23与相关因素之间的关系。结果显示中心夜间透析(INHD)组患者血磷及钙磷乘积低于传统透析(CHD)组患者,Kt/V高于CHD组,INHD组患者血磷以及iPTH达标率高于CHD组。血钙、铁蛋白、血红蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯及25羟维生素D等指标,INHD组与CHD高通组、CHD低通组差异无统计学意义。INHD组患者血清FGF23水平低于CHD组,CHD高通组与低通组差异无统计学意义。多因素线性回归结果显示血清FGF23水平仅与血钙、血磷以及钙磷乘积相关。体外实验探究不同因素对成骨细胞产生FGF23的影响及相关机制,采用Real-time PCR、免疫荧光染色方法观察成骨细胞在各种刺激作用下FGF23的表达情况。检测经siRNA干扰下调钙敏感受体(CaSR)后FGF23表达情况。采用茜素红染色观察钙磷刺激下成骨细胞的矿化情况,同时采用Real-time PCR检测矿化相关蛋白碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(bone gammacarboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)mRNA表达情况。运用Western blot方法检测钙磷刺激下,成骨细胞β-catenin及ERK蛋白表达情况。并观察ERK通路抑制剂(U0126)对成骨细胞矿化及FGF23表达的影响。结果发现1,25(OH)2D3刺激促进FGF23 mRNA表达升高,CaCl2、Na2HPO4/NaH2PO4、重组人甲状旁腺素(rhPTH)刺激成骨细胞,FGF23 mRNA表达无升高,CaCl2联合Na2HPO4/NaH2PO4刺激细胞时,FGF23 mRNA表达升高。并且5mM Na2HPO4/NaH2PO4+6mM CaCl2组,FGF23 mRNA表达最高,成骨细胞FGF23蛋白表达增强。siRNA干扰下调CaSR不影响钙磷刺激成骨细胞高表达FGF23。与对照组对比,钙磷刺激条件下促进成骨细胞ALP、BGP表达增加和矿化,β-catenin表达无差异,PERK蛋白表达增加。ERK通路抑制剂(U0126)抑制P-ERK蛋白表达后,成骨细胞矿化及FGF23表达下降。体内实验检测不同钙饮食对慢性肾衰竭大鼠FGF23表达以及骨骼、心肌肥厚及血管钙化的影响。将大鼠分为不同钙含量饮食组(高钙、正常钙及低钙组),用Micro-CT检测不同饮食干预后大鼠的胫骨生长情况。运用Real-time PCR检测大鼠胫骨组织ALP、BGP、FGF23 mRNA表达情况。用HE染色观察不同饮食干预后大鼠的心肌情况并采用麦胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin,WGA)染色观察大鼠心肌膜。采用vonkossa染色观察不同饮食干预后大鼠血管以及心肌钙化情况。用钙敏感受体激动剂NPS R568对高钙组大鼠进行腹腔注射2周,检测饮食干预以及药物R568干预前后大鼠血磷、血钙、PTH以及大鼠血清iFGF23水平差异。结果显示钙负荷与FGF23存在正相关关系,高钙CKD组血钙升高,FGF23水平升高,低钙CKD组血钙下降,FGF23水平降低。低钙野生型组血钙较正常组无差异,而FGF23水平较低。低钙以及正常钙CKD组骨质破坏明显,高钙CKD组较CKD另两组骨质量明显改善。高钙组胫骨ALP、BGP、FGF23 mRNA表达高于CKD正常钙组,这些指标在CKD低钙组表达低于正常钙组,与WT大鼠相比,CKD组大鼠心肌肥厚现象明显。与正常钙CKD鼠相比,高钙CKD组心肌肥厚更为严重。高钙CKD组大鼠心肌存在钙化现象,其他组未观察到阳性结果。NPS R568干预后,大鼠血钙水平下降,iPTH及iFGF23水平下降。本研究结果显示,INHD透析方式较CHD透析方式明显改善钙磷代谢,并能降低患者血清iFGF23水平,透析患者血清iFGF23水平与血钙、血磷以及钙磷乘积存在明显正相关。体外实验结果显示在一定磷浓度下钙可刺激成骨细胞FGF23表达增加,钙促进FGF23表达增加不依赖CaSR和WNT/β-catenin通路,而是通过ERK通路促进成骨细胞矿化从而刺激FGF23表达。高钙饮食刺激CKD大鼠FGF23表达上调,介导心肌肥厚加重钙化,骨的质量和矿化影响骨骼FGF23产生,通过饮食和药物降低钙负荷及钙磷乘积可显著下调血清FGF23水平,具有潜在的临床应用价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692.5

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本文编号：2377423