表达草酸分解基因的成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞的实验研究

发布时间：2018-12-16 22:02

【摘要】：【背景】原发性高草酸尿症（Primary Hyperoxalurias，PHs）是由于肝脏特异性酶缺乏引起机体草酸代谢障碍，草酸在体内大量生成，从而引起一系列临床症状的先天性疾病。临床上PHs患者通常表现为反复发生肾结石、肾钙质沉着症和肾衰竭。肝移植和肝肾联合移植目前仍然是I型PHs的主要治疗手段。但可供移植的肝来源少、移植手术难度大、手术风险及术后并发症发生率高一定程度上限制了手术的应用。细胞移植对机体的影响相比器官移植要小得多。肝细胞移植的发展有望在未来成为治疗PHs的主要手段。由于人类成熟肝细胞很难在体外大量的增殖、生存期短且快速细胞表型去分化，因此获得足够数量可代谢草酸的肝细胞及可靠的肝细胞来源是首要问题。产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter fomigenes，Ox.F）是一类可分解草酸的微生物，其降解草酸的过程主要由FCoAT和OCoAD两种关键酶参与，分别由frc和oxc基因编码。人骨髓间充质干细胞（Humanmesenchymal stem cells，hMSCs）具有向不同组织细胞分化的潜能，在体外经特定条件下可向肝细胞分化。越来越多证据表明hMSCs有望替代肝细胞成为肝细胞移植的种子细胞。根据hMSCs的特点，本课题在前期实验中选用了hMSCs细胞作为实验的种子细胞，通过基因工程技术将从Ox.F中分离出来的草酸分解基因frc和oxc导入hMSCs并在细胞中成功表达，并在体外实验证实了转染了目的基因的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）具备有降解草酸的功能。本实验拟进一步证实hMSCs-frc-oxc可向肝细胞分化，分化为肝细胞后该细胞仍具备降解草酸的功能。【目的】本实验体外培养转染了Ox.F草酸分解基因frc和oxc的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）并诱导其向肝细胞分化，并在分化成功后检测分化为肝细胞后的细胞代谢草酸的能力。从而获得大量可降解草酸的肝细胞，为肝细胞移植治疗PHs寻找可靠的细胞来源。为hMSCs作为种子细胞治疗PHs的可行性提供实验依据。【材料和方法】体外培养P4代hMSCs-frc-oxc，通过含40ug/L肝细胞生长因子（HGF）+10ug/L成纤维细胞生长因子4（FGF-4）所组成的培养液诱导其向肝细胞分化。分化过程中通过观察不同时间段细胞形态学变化。在分化第14天，第28天分别行实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot技术和免疫荧光细胞化学技术检测不同分化时间段细胞内的肝细胞特异性标记物(AFP、ALB、CK-18)以及草酸分解基因（frc和oxc）的表达情况。细胞成功向肝细胞分化后，利用离子色谱仪检测成功分化为肝细胞后的细胞培养液中草酸浓度从而判断细胞的草酸降解功能。前期实验转染了空病毒载体的hMSCs（hMSCs-vector）以及人成熟肝细胞L-02分别作为阴性对照组及阳性对照组。【结果】 hMSCs-frc-oxc可在体外成功培养。经诱导培养液培养后细胞形态逐渐变短，似多角形。RT-PCR可检测经过诱导的hMSCs-frc-oxc可成功表达肝脏特异性标志物（ALB、AFP和CK-18）和草酸分解基因（frc和oxc）。未经诱导的hMSCs-frc-oxc和hMSCs-vector未能表达肝脏特异性标志物。hMSCs-vector（无论诱导与否）未能表达草酸分解基因frc和oxc。Western blot技术检测hMSCs-frc-oxc在诱导第14、28d细胞中AFP、CK-18较未诱导组表达明显增加（P0.05），并可成功表达草酸分解基因产物（融合蛋白myc-FCoAT和flag-OCoAD）。免疫荧光细胞化学检测诱导28d后hMSCs-frc-oxc可成功表达ALB，未经诱导细胞表达则呈阴性。离子色谱仪结果显示成功肝细胞分化后的hMSCs-frc-oxc仍具有草酸降解功能，其草酸降解能力与未经诱导的hMSCs-frc-ocx相似。而作为对照组的hMSCs-vector和正常人成熟肝细胞L-02细胞组则几乎无草酸降解功能。【结论】 hMSCs-frc-oxc体外经过一定条件下可成功向肝细胞分化，表达肝脏特异性的标记物及具有部分肝细胞的功能，而且经过诱导分化后的细胞仍然能持续表达草酸分解基因frc和oxc及其产物，保持了代谢草酸的能力。分化后细胞的代谢草酸能力与未经诱导分化的hMSCs-frc-oxc相似。hMSCs-frc-oxc成功向肝细胞分化，证实了hMSCs能够作为种子细胞用于PHs细胞移植治疗。为高草酸尿症，特别是PHs的治疗提供了广阔的细胞来源。为应用hMSCs细胞移植治疗PHs提供了新的治疗思路和实验依据。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R696

【参考文献】