长链非编码RNA-PCA3在前列腺癌中的功能及分子机制的初步研究

发布时间：2018-12-20 08:49

【摘要】：第一部分：pGLV3/H1-shRNA干扰稳转株及pCDH-GFP-PCA3过表达稳转株的筛选与验证目的：PCA3基因在前列腺癌中高度特异性的表达,预示着PCA3对前列腺癌的发生发展起着重要作用。目前,PCA3在前列腺癌中的功能及机制尚不清楚。为了探究其功能,我们通过构建PCA3的干扰及过表达载体,并筛选出相应的稳转株,为后续的体外功能研究提供依据。方法：从Genbank中查找PCA3基因的序列号及其对应序列,使用Premier 5.0软件设计针对PCA3分子的shRNA,分别构建4对pGLV3/H1-sh2456, pGLV3/H1-sh2618, pGLV3/Hl-sh2702及pGLV3/H1-sh2913干扰载体及pGLV3/H1-control对照,以下调其在LNCaP细胞中的表达。将构建好的干扰载体包装成病毒后感染LNCaP细胞,经real time PCR验证后筛选出干扰效率较高的细胞株；从PCA3高表达的前列腺癌细胞系LNCaP中提取总RNA,然后反转录成cDNA。设计三对引物,以cDNA为模板扩增3个分片段,通过重叠延伸后连接成全长构成PCA3。将PCA3与pCDH-GFP质粒分别进行双酶切后进行连接,转化感受态细胞DH5a,挑选克隆后并经PCR、酶切进行验证,送测序,。将构建好的pCDH-GFP-PCA3表达质粒包装成病毒后感染前列腺癌细胞株DU145及PC3,流式分选并经real time PCR验证后获得分别过表达PCA3及含空载的稳定细胞株。结果：测序结果表明成功构建了干扰载体,而且real time PCR结果同时证实并建立了稳定低表达PCA3的前列腺癌细胞株及稳定高表达PCA3的前列腺癌细胞株。结论：PCA3干扰及过表达载体的成功构建,为深入研究PCA3基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础,进而为探索前列腺癌治疗的新途径提供了可能。第二部分：研究PCA3干扰和过表达后对前列腺癌细胞功能的影响及机制的初步研究目的：研究PCA3干扰和过表达后在体外对前列腺癌细胞的增殖、周期、迁移及侵袭的影响。方法：将第一部分筛选出的稳转细胞株,通过CCK-8法(PCA3过表达实验)和EdU法(PCA3干扰实验)及细胞克隆形成实验测定细胞增殖能力,通过流式细胞仪测定细胞周期,transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力。并将存在功能差异的干扰细胞进行转录组测序,探求两组细胞在转录水平分子的表达差异。结果：下调PCA3的表达后,LNCaP细胞株实验组较对照组的增殖能力下降(P0.05),且迁移(P=0.0001)与侵袭(P0.0001)能力也显著下降,差异有统计学意义。而在DU145及PC3细胞中过表达PCA3后,细胞在增殖、迁移及侵袭的生物学功能方面与对照组相比无明显差异。转录组测序结果发现,下调PCA3分子后,实验组中与细胞粘附信号通路的基因表达有明显的下降,而参与TGF-beta信号通路的基因表达明显上升。结论：PCA3可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用,下调PCA3后能显著抑制前列腺癌细胞株LNCaP的生长及迁移侵袭能力,预示着PCA3可能是治疗前列腺癌的一个潜在靶点。转录组测序结果提示,PCA3分子可能通过影响细胞粘附分子的表达及TGS-beta的表达水平来影响细胞的增殖、迁移及侵袭。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

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