聚合物纳米组装体对肾病大鼠蛋白尿和足细胞病变的治疗研究

发布时间：2018-12-29 17:16

【摘要】：研究背景慢性肾病是肾损害或肾功能减退持续3个月以上,严重的导致尿毒症的一组疾病。慢性肾病发病率高,致残致死率高,治疗费用昂贵,严重影响人们的健康和生活,已成为当前重要的“全球公共健康问题”。此病的早期通常是隐匿无症状的,常在诊断并发症的时候被查出,早期慢性肾病是可逆的。快速发展的肾病在数月之内能导致肾衰,但是,大部分肾病都会潜伏数十年,甚至有些病人在后续的数年间病情不会恶化。所以在慢性肾病的早期作出诊断并进行治疗非常有必要。大量的研究证明,尿蛋白和肾病的发展是密切相关的。蛋白尿是普通人群肾病风险和慢性肾病患者的标志,也是导致肾病变的主要因素。研究发现,大量白蛋白尿患者的肾病恶化和心血管疾病的死亡率比微量白蛋白尿或正常白蛋白尿患者高约6倍。尤其是大量白蛋白尿(即每天总蛋白的排泄量大于500 mg)总是与临床上的尿蛋白和肾功能恶化相联系。蛋白尿主要从以下几个方面以病理角色参与肾功能的进一步下降：1、血浆中各种成分,如补体、生长因子、炎性介质的超滤和蛋白质量和质的改变,可加重白蛋白尿的肾毒性；2、大量的蛋白尿能引起体液潴留和高血压,血脂异常和内皮功能紊乱；3、足细胞上过多的蛋白负载,能释放一种将肾小球系膜细胞转化成纤维母细胞的转换生长因子β(TGF β),从而加剧肾小球细胞损伤；4、产生增多的尿蛋白,通过形成膜攻击复合物与特殊受体结合,从而活化肾内级联补体,亦能促进损伤发展。因此,如何减少或消除尿蛋白的漏出,是治疗或修复肾病的关键。蛋白尿的发生与肾小球滤过膜功能异常密切相关。肾小球滤过屏障如有基因性或获得性缺陷,都能导致肾小球滤过膜的损害、蛋白尿和肾病。在所有病理肾小球性蛋白尿中,都会出现大分子物质(以白蛋白为主)不断从屏障滤出。导致肾小球滤过膜功能异常的病因有很多：1、已被证明由透明质酸酶和阿霉素破坏内皮细胞的糖萼层后诱发了蛋白尿；2、肾小球基底膜固有的电荷层被破坏,带有负电荷的白蛋白就容易漏出；3、在临床上各种足细胞病表现为蛋白尿。目前对肾小球疾病的药物治疗存在不足,仅仅是延缓多数疾病的进展,主要是控制全身的辅助因子,而不是根本病因或首要介导者。对肾小球病如糖尿病性肾病,最重要的治疗是用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),它们都有抗高血压和抗蛋白尿作用；此外,免疫肾小球病,例如膜性肾病,是用免疫调节剂如糖皮质激素,钙调磷酸酶抑制剂(如环孢霉素A)和细胞毒性药物(如环磷酰胺)进行治疗,这些药物是有效的,但有相当大的副作用,而且病情容易反复。因此寻找治疗慢性肾病的药物无疑是当前肾脏病卫生战略重点之一。一直以来,特别是近几年,组装(Self-assemble)因在创造新物质、产生新功能和在医学诊断和治疗等领域的巨大潜力和优势而受到科学家们的广泛关注和重视,是二十一世纪亟待解决的25个重大科学问题之一。组装的概念最初源自生命科学,是指单个生物分子通过弱键相互作用(范德华力、静电力、疏水作用、π-π键、氢键和配位键)自发组织或集聚,形成有序结构的过程,如蛋白质的折叠聚集、生物膜的形成,甚至复杂生命有机体的形成。目前,生物分子纳米组装体已经广泛用于细胞、组织乃至生物体的治疗和检测。因此,如何通过生物组装研制具有类似肾小球过滤膜性质的生物膜是治疗或修复肾功能迫切需要研究开发的课题。为使生物膜靶向到肾小球,需要寻找肾小球滤过膜上的特异蛋白。大量研究证明Nephrin是肾小球滤过膜上的特异蛋白。因此我们开展了如下研究：1、为防止大量蛋白滤出肾小球滤过屏障,我们将带负电荷的聚合物组装成不同形态、大小的纳米粒子,再与Nephrin抗体组装成抗体—聚合物复合物,简称为聚合物纳米组装体(PMb-anti-nephrin),使聚合物纳米组装体能特异靶向到肾小球,阻止蛋白通过,从而降低尿蛋白。2、用足细胞在体外探索聚合物纳米组装体(PMb-anti-nephrin)的毒性和对足细胞的特异靶向性。3、通过建立白蛋白肾病模型、嘌呤霉素氨基核苷肾病模型(PAN)和阿霉素肾病模型(ADR),验证聚合物纳米组装体(PMb-anti-nephrin)对尿蛋白和足细胞病变的影响,并对其机制进行探讨。第一部分聚合物薄膜(PMb-anti-nephrin)的组装及其与nephrin抗体的偶联研究目的本论文基于组装的原理,将带负电荷的聚合物组装成孔径和片状大小适合的多孔薄膜。实验方法1、制备聚合物,2、聚合物电荷性修饰,3、多孔薄膜自组装,4、荧光素FITC的链接,5、多孔薄膜修饰抗-nephrin 。实验结果通过组装法成功地合成了负电性的多孔薄膜,且其大小和孔径可调。多孔薄膜成功地接上了nephrin抗体,能特异性地靶向到肾小球滤过膜上。实验小结制备得到的薄膜具有负电性和多孔性,能够模拟肾小球滤过膜的功能,且其生物相容性好,为慢性肾病治疗提供新思路。第二部分PMb-anti-nephrin对足细胞的特异靶向和对其活力的影响研究目的据研究,nephrin是肾脏特异性分子,仅表达于足细胞的基底面,而且主要聚集于足细胞指状突起处。因此,本研究通过把nephrin的特异抗体链接在PMb聚合物纳米组装体上,观察纳米组装体PMb-anti-nephrin对足细胞的特异靶向性和其对足细胞生长活力的影响。实验方法小鼠永生化足细胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基传代培养,未分化的足细胞于33℃、10 U/m1的重组小鼠γ-干扰素的诱导下增生,为使足细胞分化,于37-C、无重组小鼠γ-干扰素的培养基中培养10～14 d,细胞贴壁生长,每2-3 d传代一次。足细胞达70%～80%融合后换成无血清培养液培养6h后进行实验。用CCK-8法测定细胞的活力,免疫荧光染色检测纳米组装体PMb-anti-nephrin能否接合到足细胞上。实验结果在一定的浓度范围内,PMb-anti-nephrin对细胞活力无影响。CCK-8细胞毒性实验发现高浓度(10mg/ml)的PMb-anti-nephrin对细胞有一定的毒性作用,但是,低浓度(0.1 mg/ml)的PMb-anti-nephrin对细胞无毒性作用。细胞免疫荧光的结果显示,先加入nephrin抗体占据表达在细胞膜的抗原结合位点,随后加入的PMb-anti-nephrin未能结合到细胞上；未链接nephrin抗体的PMb也难以结合到细胞上；而直接加入的PMb-anti-nephrin能成功靶向到足细胞上。实验小结1、高浓度的PMb-anti-nephrin对细胞有一定的毒性作用,但是,低浓度的PMb-anti-nephrin对细胞无毒性作用。这为后期在体内实验进行干预提供了剂量范围的参考。2、通过nephrin抗体,PMb-anti-nephrin能成功靶向到足细胞上。第三部分PMb-anti-nephrin对蛋白负荷、嘌呤霉素氨基核苷和阿霉素肾病鼠的蛋白尿和足细胞病变的影响研究目的通过建立大鼠蛋白负荷、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)和阿霉素(ADR)肾病模型,验证PMb和PMb-anti-nephrin对蛋白尿和足细胞病变的影响,并对其机制进行初步探讨。实验方法白蛋白肾病模型：雌性正常Wistar-Kyoto大鼠40只(初始体重100-150 g),购于南方医科大学动物实验中心,分别进行右肾全切术或假手术。1周后手术组给予BSA溶液腹腔注射,以5g/kg/d BSA腹腔注射,每周6d, BSA注射后第3天给与BSA+PMb组每只尾静脉注射PMb 30 mg/kg,4天注射一次,BSA+PMb-anti-nephrin组每只尾静脉注射PMb-anti-nephrin 30 mg/kg,4天注射一次,BSA+Saline组每只尾静脉注射等体积的0.9%生理盐水,4天注射一次。在注射BSA后的第32天处死大鼠。PAN肾病模型：雄性正常SD大鼠24只,用无菌生理盐水将PA粉末配成20mg/ml溶液以150 mg/kg单次腹腔注射,PA注射后第3天随机抽取16只PAN肾病大鼠,8只给与尾静脉注射3 mg/kg PMb-anti-nephrin,另8只给与尾静脉注射等量生理盐水,在注射PA后的第10天处死大鼠。ADR肾病模型：雄性正常BABL/c小鼠24只,用无菌生理盐水将AD粉末配成2 mg/ml溶液以10 mg/kg单次尾静脉注射,AD注射后第3周随机抽取16只AD肾病小鼠,8只给与尾静脉注射30 mg/kg PMb-anti-nephrin,另8只给与尾静脉注射等量生理盐水,在注射PA后的第5周处死小鼠。实验期间,收集24 h或12h尿液,用于尿蛋白定量,采用考马斯亮蓝-G 250法进行检测；定期眼球采血用于血肌酐的测定。刺激结束后,经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(35 mg/kg)后摘取心、肝、肺、肾等组织,HE和Masson染色观察组织病理,免疫荧光染色检测Podocin的蛋白表达,透射电镜染色观察足细胞的病变。实验结果由白蛋白模型肾病的24 h尿蛋白变化趋势可见,PMb最高能使尿蛋白降低300mg(P0.05);而PMb-anti-nephrin最高能使尿蛋白降低500 mg(P0.05)。但两者均不能使尿蛋白降至正常。而当第35天到41天停止干预后,尿蛋白又开始上升。由PAN肾病的24 h尿蛋白变化趋势可见,PMb-anti-nephrin能显著降低尿蛋白(P0.05),但不能使尿蛋白降至正常。由ADR肾病的尿蛋白变化趋势可见,在第3周给与PMb-anti-nephrin干预后,尿蛋白明显下降,与同时期的ADR组相比,在第5周使尿蛋白降低将近一倍；升高的血肌酐则在干预两周后明显下降,同时下降的肾小球滤过率也明显上升。从各重要脏器的病理染色可看出,PMb聚合物纳米组装体是安全无毒害的。从肾小球的光镜染色也可看出,PMb和PMb-anti-nephrin能使肾间质的炎症细胞明显减少,大量蛋白管型消失,肾小管细胞的形态有所恢复。由足细胞的标记蛋白Podocin的免疫荧光可看出,给与PMb和PMb-anti-nephrin降低尿蛋白后,从沿肾小球毛细血管袢不连续细颗粒样的分布转变为线样分布,说明表达下降的Podocin蛋白有了明显升高(P0.05)；透射电镜(TEM)的结果进一步证实了这一点,蛋白尿肾病组肾小球足突不同程度变宽；足细胞高度肿胀,胞质内有明显的空泡变性；足突弥漫性融合、消失,融合的足突内可见微丝节段聚集形成斑块样结构。给与PMb与PMb-anti-nephrin干预后这些病变明显改善,镜下仅见足突部分融合、变宽。实验小结1、聚合物纳米组装体(PMb-anti-nephrin)能显著降低尿蛋白。蛋白尿的治疗效用归因于多孔薄膜模拟了滤过膜和具有负电荷性。2、聚合物纳米组装体能显著改善肾脏的病理变化和足细胞的进一步损伤。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

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