脐带间充质干细胞增强无精子症模型睾丸特异性基因表达以及精子发生中GRTH蛋白结合基序与TP2 mRNA作用区域研究

发布时间：2019-01-18 12:57

【摘要】：第一部分：脐带间充质干细胞增强无精子症小鼠睾丸特异性基因表达目的在生殖男科领域,探索人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)对无精子症的治疗作用,通过移植HUCMSCs进入无精子症小鼠模型,检测生殖细胞特异性基因的表达,证实生殖细胞特异性基因的表达上调,从而表明HUCMSCs对睾丸生精功能的恢复可能具有促进作用。由此探索一条治疗无精子症的新途径。方法 1、无精子症小鼠模型的建立雄性8周龄BALB/C小鼠80只,采用腹腔内单次注射白消安35mg/kg。注射白消安后的第5周,切取5只小鼠的睾丸,HE染色后,观察睾丸的生精上皮结构变化,确定模型的构建情况。剩余存活小鼠用于细胞移植实验。 2.HUCMSCs的原代培养及鉴定在获得知情同意书的前提下,取不同个体来源的脐带组织分别处理,PBS洗涤,获得华通氏胶,采用组织块法,将组织剪碎成1mm3大小,并贴于培养瓶内,根据干细胞本身的贴壁能力,将细胞培养在37℃,5%CO2培养箱中。每3-4天换液。待细胞融合度达到80%,进行细胞传代。收取培养的第三代HUCMSCs用于移植实验。HEK293细胞作为对照组,同时进行正常培养。对生长良好的第三代]HUCMSCs进行鉴定,采用流式细胞术,分别检钡FITC-CD73, PE-CD105,ACP-CD31等表面抗原标志物的表达。通过G显带技术对第三代HUCMSCs进行核型分析。对第三代HUCMSCs分别进行成骨和成脂肪诱导分化,诱导21天后,分别使用茜素红和油红O,对诱导分化后的细胞进行染色。 3.HUCMSCs移植进入无精子症小鼠模型睾丸取第三代HUCMSCs用于移植实验。注射浓度为1×107cell ml-1。取40只构建成功的无精子症模型小鼠,随机分为4组,每组10只：第一组不注射作为空白对照组；第二组注射生理盐水作为阴性对照组；第三组注射HEK293细胞；第四组注射HUCMSCs。注射部位均为左侧睾丸,右侧睾丸不作处理设为对照。每次注射剂量为10μl。 4、睾丸特异性基因表达的检测分组移植后第三周,于每组各取5只小鼠,取双侧睾丸组织,分别提取RNA,逆转录之后,对生殖细胞特异性的、减数分裂相关的10个基因进行PCR扩增。基因分别是vasa, Scp3, Cyclin A1, Dazl, Stra8, miwi, Tnp2, Pgk2, Akap3, Tex18。β-actin基因作为内参同时被检测。对每只小鼠的两侧睾丸进行比较。实验结果统计分析采用mean±D, p≤0.05表示有显著差异。同时,于各组另取5只小鼠,取两侧睾丸组织,分别提取总蛋白。Western Blot检测生殖细胞特异性的vasa, miwi, Scp3蛋白的表达。β-actin作为内参同时被检测。对两侧睾丸进行比较后,实验结果采用mean±SD进行统计分析,p≤0.05表示有显著差异。结果 1、无精子症模型建立：注射35mg/ml白消安5周之后,对睾丸组织进行HE切片分析。结果显示,曲细精管的管壁变薄,大量生殖细胞,包括精母细胞、精子细胞、以及成熟精子都被去除,仅保留少量精原细胞以及支持细胞。睾丸显示为无精子状态。 2、HUCMSCs的培养以及鉴定：使用组织块法对HUCMSCs进行原代培养并传代。对第三代HUCMSCs进行鉴定。流式细胞术检测结果显示,HUCMSCs能够表达CD73, CD105等间充质干细胞表面抗原标志物,不表达CD31造血系细胞表面标志物；G显带分析结果显示HUCMSCs核型正常；HUCMSCs经成骨和成脂肪诱导分化21天之后,茜素红和油红O分别染色均呈现阳性。 3、HUCMSCs移植进入无精子症小鼠模型睾丸：分组注射左侧睾丸后,分笼正常饲养小鼠3周,期间小鼠状态良好,没有出现死亡。 4、移植3周之后,注射了HUCMSCs小鼠的睾丸中,生殖细胞特异性基因的表达明显高于对侧未注射HUCMSCs的睾丸组织；而注射了生理盐水和HEK293细胞的睾丸,较对侧相比,生殖细胞特异性基因的表达没有明显变化。对各组的比较分析结果显示,注射了HUCMSCs之后的小鼠睾丸,生殖细胞特异性基因的表达水平明显高于注射了生理盐水和HEK293细胞的睾丸组织。在检测vasa, miwi, Scp3等生殖细胞特异性蛋白的表达时,注射了HUCMSCs的睾丸组,明显高于注射了生理盐水和HEK293细胞组。结论 1、采用适当剂量的化疗药物白消安,在保证动物存活率的情况下,可以成功诱导小鼠无精子症模型。从而保证了其作为受体进行干细胞的移植实验。 2、经组织块法原代培养的HUCMSCs,减轻了消化酶对细胞可能造成的不利影响。采用低代次的HUCMSCs进行移植,细胞几乎不存在免疫原性。对HUCMSCs细胞特性的检测,方法简便有效。 3、确定HUCMSCs对生殖细胞特异性基因的表达具有促进作用。通过与注射生理盐水和HEK293细胞的睾丸对照组进行比较,说明促进作用不是由注射过程或导入异源细胞本身所引起。 4、探索干细胞治疗无精子症的可能性。并为干细胞治疗成为辅助生殖技术的补充,应用于治疗无精子症提供了实验依据。第二部分精子发生中GRTH蛋白结合基序与TP2mRNA作用区域的研究目的促性腺激素调节睾丸RNA解旋酶(GRTH/DDX25),是一个睾丸特异性的蛋白,属于RNA解旋酶中的DEAD box家族,高表达于减数分裂粗线期、中期精母细胞和圆形精子细胞中。这个蛋白受发育调节的控制,并主要在转录后水平对精子发生进行调节。为了理解GRTH t何在转录后水平对过渡蛋白2(TP2)进行调节,本研究重点阐明GRTH蛋白与生殖细胞特异性TP2mRNA转录物结合的作用区域。通过鉴定GRTH的RNA结合基序以及TP2生殖细胞转录物的结合位点,明确3'UTR顺式作用元件的作用区域,进而深化GRTH在生殖细胞发育过程中对TP2转录本的调节机制的认识。这一研究对于进一步理解雄性生殖功能具有重要意义。方法 1、GRTH全长、截短序列以及TP23'UTR重组质粒的构建使用小鼠睾丸组织的cDNA为模板,PCR扩增GRTH全长片段(NM_013932.4)和TP23'UTR区域片段(TP2, NM_013694, nt408-535)。将GRTH全长片段插入带有Hind3和Xbal位点的pcDNA3.1(+)载体,构建GRTH全长重组质粒。根据GRTH截短片段的设计,分别进行扩增并连接到pcDNA3.1(+)载体,标记为：pcDNA3.1-483(a.a1-483), pcDNA3.1-G423(a.a1-423), pcDNA3.1-G115-483(a.a116-483), pcDNA3.1-G138(a.a1-138), pcDNA3.1-G166(a.a1-166), pcDNA3.1-G244(a.a1-244), pcDNA3.1-G325(a.a1-325), pcDNA3.1-G388(a.a1-388)。将TP23'UTR片段插入带有Hind3和EcoRl位点的pST18载体。构建TP23'UTR重组质粒。 2. GRTH全长(G483)突变重组质粒的构建使用QuickChange mutagenesis kit将G483的第V结构域由ARGID突变为AAAID,记为G483Vx将第Ia结构域由PTYELA突变为PTSALA,记为G483Iax;随后使用G483Vx质粒为模板,突变其第Ia结构域,记为G483IaxVx。测序验证。 3、体外转录和翻译系统表达GRTH全长、截短片段蛋白以及Western blot检测将1μg GRTH全长、截短片段以及突变重组质粒,使用TNT兔网织红细胞蛋白提取物系统,300C孵育90min。Western blot检测蛋白表达。 4、生物素末端标记TP23'UTR以及分段合成TP23'UTR的RNA 线性化pST18-TP2-3' UTR质粒,使用T7RNA polymerase体外转录系统合成TP23'UTR的RNA；使用T4RNA ligase将RNA与生物素进行连接,总共标记50pmol的RNA,随后采用dotting实验检测标记效率。将127nt长度的TP23'UTR分为3段,每2段之间有10nt的重叠区间,每段大约50nt,分别标记为T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)。同时合成生物素标记的探针和非标记的探针,后者用于竞争性结合。 5、RNA凝胶电泳迁移实验检测GRTH各蛋白与TP23'UTR片段的相互作用每个反应都是使用20fmol生物素标记的RNA探针与4pmol蛋白共同孵育。安排如下：首先进行GRTH全长蛋白(G483)与TP23'UTR RNA的结合实验；随后分别进行G483、G115/483.、G423、G388、G325、G244、G166、G138与T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)的结合实验；在超泳动实验中,加入anti-V5抗体,分别检测G483、G115/483、G423、G388、G325、G244与T1(381/430)、T3(461/510)的相互作用；使用GRTH的突变重组质粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx的表达蛋白与T1(381/430)探针进行结合实验。所有结合反应均使用Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit进行检测。结果 1、RNA-EMSA分析GRTH和127nt TP23'UTR转录物的相互作用。为了明确GRTH蛋白与TP23'UTR转录物结合的特异性结合基序,首先根据RNA解旋酶蛋白的普遍存在的保守基序,设计了GRTH截短片段的序列。每一个GRTH截短片段的C端都有V5标签标记。Western blot结果显示,由体外转录和翻译系统表达的GRTH的各个截短片段与预期一致。当使用GRTH全长片段(G483)蛋白与TP23'UTR转录物相互作用时,首先构建TP23'UTR的克隆并转录为RNA,并在其末端标记生物素。RNA-EMSA显示,G483可以和TP23'UTR转录物相结合,当加入竞争性探针时,能够阻滞标记了生物素的TP23'UTR探针结合。 2、RNA EMSA分析GRTH截短片段蛋白与TP23'UTR分段探针的结合。为了进一步明确TP23'UTR区域顺式作用元件与GRTH蛋白的相互作用,我们设计了3个连续的、有重叠序列区间(10nt)的寡核苷酸探针。同时为了系统分析GRTH与TP2转录物结合基序的结合属性,采用DDX19的晶体结构模型作为参照。结果所示,G483蛋白可以和T1探针(48nt)形成蛋白-RNA复合体,T1探针位于紧接TGA终止密码子的区域,同时可见GRTH与T3(78-127nt)探针也形成了复合体。这个结果同样出现在G423蛋白与TP23'UTR转录物的结合实验中。G388与TP23'UTR T1探针作用时,实验中并没有出现特异性结合的条带。G423中包含Motif V,而G388中不含Motif V。说明Motif V在T1与GRTH的结合中可能起到了关键作用。T2探针不能与GRTH全长以及各截短片段蛋白相互作用,说明介于T1和T3之间的序列区域不能发挥顺式作用元件的功能与GRTH结合。 3、G325是缺失了domain II序列的蛋白,domain II包含motifs IV, Vand VⅥ。G325可以和T1探针结合,有两条带出现。而T1在与G244的结合中,只能检测到一条带。在G325和G244结合实验中,两者都不能和T2、T3结合。这表明在GRTH的domain I区域存在另一个RNA结合位点。G166、G138两个蛋白都是缺失了Ia结构域序列的蛋白,而Ia结构域在RNA解旋酶中被认为是RNA结合位点,实验证实G166、G138不能与TP23'UTR转录物的所有片段结合。这说明了Ia结构域对于GRTH结合于RNA转录物的重要性。 4、G115/483是去掉N端114个氨基酸序列的GRTH蛋白,其与TP23'UTR转录物的结合特征相似于G483：能够与T1、T3探针结合。此结果与G138的结合特征具有一致性,说明GRTH蛋白N端1146个氨基酸对RNA结合没有贡献。G115/483与T3探针的结合反而增强。 5、Supershift实验分析GRTH-TP23'UTR RNA的结合。在加入anti-V5抗体之后,(G483, G115/483, G423, G325与T1探针结合的复合体都出现了超泳动。同样发生与T3探针的结合实验中。 6、EMSA分析GRTH突变重组蛋白与TP23'UTR的结合。GRTH的突变重组质粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx蛋白与T1(381/430)探针分别作用。结果显示,单独突变GRTH的一个RNA结合点时,结合反应仍然发生,但是当同时突变2个RNA结合位点时,不出现结合反应。说明GRTH在与TP23'UTR的结合过程中,2个RNA结合位点很可能是协同发挥作用。结论 1、证实了GRTH蛋白的RNA结合结构域可以和TP23'UTR的RNA相互作用。这一结果和理论上RNA解旋酶中的Ia结构域、V结构域具有RNA结合功能相吻合。同时证明2个RNA结合位点很可能是协同发挥作用。 2、研究证实,紧接TP2终止密码子的3'UTR区域的50bp序列(T1区间),相对于其它区域,对于与GRTH的结合具有更重要的作用。 3、本研究所证实GRTH蛋白与TP2RNA形成特异性的RNA结合复合体,进一步明确了GRTH作为mRNP的组成,参与了TP2RNA信息从细胞核向细胞质的运送。 4、通过对GRTH蛋白中的保守RNA结合基序的研究,深化了对TP2在转录后水平的表达调控的理解,进一步认识了多核糖体位点的相关组成部分。 5、GRTH (DDX25)蛋白与其同系物DDX19蛋白晶体结构的相似性很高。从而说明了RNA结合结构域(Ia和V)结合并调节相关RNA的普遍性。通过对GRTH在基因表达调控中作用的研究,进一步认识了GRTH在生殖细胞伸长和完成精子发生中所起到的重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R698.2

【共引文献】