重组对虾抗菌肽Penaeidin-2对肾癌细胞的作用及小菜蛾抗菌肽pxCECA1抗淋球菌活性的研究

发布时间：2019-01-19 12:25

【摘要】：Penaeidin-2是来源于南美白对虾(Penaeus vannamei)的一种重要的抗菌肽,兼具抗细菌和抗真菌活性。重组表达的Penaeidin与天然的Penaeidin具有非常相似的生物学活性。最新的研究表明,一些阳离子抗菌肽具有抗肿瘤活性,但是同样作为阳离子抗菌肽,并未有研究关于rPen-2抗肿瘤作用的报道。肾细胞癌(RCC)起源于肾小管或集合管上皮细胞,是成人最常见的肾部肿瘤,在成人肿瘤病例中占到了3%。肾细胞癌对化疗和放疗均具有抗性,选择和发展新的肾细胞癌治疗方式和药物显得非常必要。在本研究中,我们评估了重组抗菌肽Penaeidin-2(rPen-2)选择性杀灭肾癌细胞株ACHN和A498的效果和作用机制。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法显示相对于正常肾细胞株HK-2, rPen-2对肾癌细胞具有较高的细胞毒性和抑制生长活性。实验结果表明,当rPen-2浓度为100μg/mL时rPen-2对肿瘤细胞生长有最大的抑制作用,此作用表现为剂量依赖性。同时rPen-2的抑制作用随着作用时间而增强,使用100μg/mL rPen-2处理细胞48小时后,ACHN和A498的最大抑制率分别为62.4%和70.4%,而此时HK-2细胞株的抑制率仅为13.2%。 DNA特异性染色和流式细胞分析显示肿瘤细胞出现了高比例的凋亡。Hoechst33258染色发现肾癌细胞在经过100μg/mL rPen-2处理24h后,相对于正常细胞HK-2,肿瘤细胞出现了更多的凋亡。AO/EB双染用于区分早期凋亡和晚期凋亡以及坏死,在肿瘤细胞中可以观察到这些特征,同时一些细胞的细胞膜似乎也出现了损伤。为了更进一步证明细胞的凋亡,运用流式细胞术Annexin V/PI双染对细胞进行分析并得到了相似的结果。流式细胞分析显示,在用rPen-2处理24-48小时后,HK-2, ACHN和A498的死亡率分别为6.2-15.8%,28-62.9%,和41.7-71.5%,其中早期凋亡的比例分别为6.7-12.0%,22.7-33.7%和25.3-38%,晚期凋亡的比例分别为0.4-3.2%,1.7-32.5%和3.1-36.2%。乳酸脱氢酶(LDH)漏出实验表明,使用100μg/mL rPen-2处理24-48小时后的HK-2, ACHN和A498细胞的LDH漏出率分别为3.4%-5.3%,25.6%-32.3%,33.8%-35.3%,这些结果说明rPen-2对肾癌细胞具有选择性杀伤作用,而杀伤的模式包括凋亡和直接裂解细胞。激光共聚焦显微镜以观测rPen-2和细胞作用的动态过程。激光共聚焦显微镜显示rPen-2在作用1小时后开始结合到HK-2的细胞膜,但是在整个作用过程中,这种结合非常的微弱,然而,在肿瘤细胞中,大量的rPen-2结合到细胞膜并且迅速的进入到了细胞内部。结果表明细胞膜是rPen-2和肿瘤细胞相结合并杀伤肿瘤细胞的关键位点,但是rPen-2进入并定位于细胞质和细胞核说明rPen-2对肿瘤细胞的杀伤尚有一些其他的机制。扫描电镜(SEM)显示了由rPen-2处理后肿瘤细胞膜的形态学变化。经rPen-2作用的正常细胞呈现出光滑的膜表面,而肿瘤细胞的细胞膜则表现出现了褶皱,穿孔等形态学改变。本研究首次对重组对虾抗菌肽Penaeidin-2的肾癌细胞的作用进行了探索,发现重组对虾抗菌肽Penaeidin-2对肾癌细胞有选择性杀伤作用,而对正常肾小管上皮细胞影响非常小。由于抗菌肽主要作用于细胞膜的杀伤肿瘤方式,能够有效避免肾癌细胞的药物抗性,这为开发治疗肾细胞癌新药方面提供了一种可行的新思路。抗菌肽(AMPs)是生物进化过程中形成的先天防御系统的重要组成部分,广泛的存在于各种生命形式中。抗菌肽兼具抗革兰氏阳性菌和抗革兰氏阴性菌的能力,同时也具备抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性。研究表明,抗菌肽主要通过攻击细胞膜的方式来杀伤细菌和微生物,这种杀伤模式对抗性菌和敏感菌同样有效。抗菌肽也有其他的杀伤模式,例如在进入细胞后攻击核染色体和核糖体等等。抗菌肽的生物学活性不仅仅是杀伤作用,在一些高等动物体内,抗菌肽也扮演作为细胞的趋化性因子,参与机体的免疫应答等作用。与传统抗生素相比,抗菌肽主要作用于细胞膜,具有抗菌谱广,杀伤速度快,能够避免细菌产生耐药性等特点,也可与传统抗生素合用产生协同效应,因此,抗菌肽是目前新型抗菌药物研发的热点。淋病奈瑟菌是淋病的病原菌,淋病是在我国最主要的性传播疾病之一,其发病率居我国性传播疾病第二位。近年来,随着抗生素的广泛使用,临床上出现了多种淋病奈瑟菌耐药株,对青霉素类,大环内酯类,喹诺酮类等临床常见抗生素普遍具有抗性,其中甚至有拮抗临床上所有抗生素的超级抗菌株的出现,已经极大的威胁到人类健康,因此,研发新型抗淋病奈瑟菌药物势在必行。本研究使用了小菜蛾抗菌肽pxCECA1,这种由本实验室分离得到的阳离子抗菌肽具有表达量大,易于纯化,生物学活性较高等特点,实验室先前的研究表明,小菜蛾抗菌肽pxCECA1对大肠杆菌、绿脓杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌都具有抗菌活性。本实验中,pxCECA1对大肠杆菌和青霉素抗性的大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)均为2μg/mL,表现出比融合表达的抗菌肽更好的抑菌活性。我们使用小菜蛾抗菌肽pxCECA1作用于无抗性淋病奈瑟菌和多重耐药性淋病奈瑟菌,其MIC值均为4μg/mL,在较小的药物浓度内取得了较好的抗菌效果；生长抑制实验和杀菌实验表明,pxCECA1对淋病奈瑟菌的抗菌能力呈剂量依赖关系,pxCECA1的抗菌能力体现为杀死细菌,而不仅仅是抑制细菌生长,而且这种直接杀伤作用在无抗性淋病奈瑟菌和多重耐药性淋病奈瑟菌上并无明显差别。与头孢曲松钠合用的协同抑菌实验表明,pxCECA1能够和头孢曲松钠产生协同抑菌作用,pxCECA1和头孢曲松钠的使用剂量都可以大大降低,不仅仅可以减少药物使用剂量,也可以防止耐药性的产生。这为临床上开发对淋病奈瑟菌多重抗性株治疗药物方面提供了实际可行的方法。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11

【共引文献】