人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复作用及机制研究

发布时间：2019-02-09 11:51

【摘要】：目的随着经济的发展和人们生活方式的改变,我国慢性肾脏病(CKD)的发病率呈逐年上升趋势,CKD大多起病隐匿,且目前尚缺乏早期诊断和治疗方法,部分患者将进展至终末期肾脏疾病(ESRD)。腹膜透析(PD)是ESRD的主要替代治疗方法之一。然而,腹膜长期暴露于非生理性的腹膜透析液会造成腹膜间皮细胞(PMCs)层损伤、脱落、表型改变、新血管生成增加、细胞外基质沉积和炎细胞浸润,最终导致腹膜纤维化(PF)。PF迄今仍然是一个世界性的难题,尚缺乏有效的防治对策,治疗上主要以预防为主,是导致ESRD患者被迫中断长期腹膜透析的最主要因素,制约了腹膜透析的应用和发展。因此,如何延缓、阻断PF进程,已成为本研究领域的一个亟待解决的重要问题。间充质干细胞(MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层,属于多能干细胞,在特定的诱导条件下,可修复器官的损伤及治疗器官纤维化。本实验室旨在建立稳定的、标准化的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养方法,并且在能够保证hUC-MSCs长期培养的基础上,用于PF的修复研究并对修复机制进行探讨,为hUC-MSCs治疗PD相关PF奠定理论基础,为干细胞在肾脏病领域的应用开拓积累经验。对象与方法取新鲜脐带组织,以组织贴块法对脐带中的hUC-MSCs进行分离、培养、传代,并诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化,以流式细胞仪鉴定所分离的细胞为hUC-MSCs。以甲基乙二醛(MGO)加入2.5%腹膜透析液配置成20mmol/L的混合液,按照10ml/天连续2周腹腔注射上述混合液复制大鼠PF模型。以2×106个hUC-MSCs沿大鼠尾静脉缓慢一次性推入,对PF进行干预。2周后,进行腹膜功能评价,收集腹膜组织进行HE、天狼星红染色,免疫组化观察BMP-7、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Snail1蛋白在腹膜组织的表达变化。对大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)进行原代培养、鉴定,以2.5 ng/ml TGF-β1处理间皮细胞,并用hUC-MSCs及hUC-MSCs条件培养基(h UC-MSCs-CM)进行干预,Western Blot方法检测E-cadherin、α-SMA、pSmad2的蛋白表达变化,探讨TGF-β1/Smad2通路在hUC-MSCs修复PF过程中所起的作用。结果本实验以组织贴块法成功分离、培养了hUC-MSCs。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD90高表达,分别为98.32%和99.19%,鉴定为hUC-MSCs。MGO对Wistar大鼠腹腔注射两周后,免疫组化分析显示,腹膜组织Snail1、TGF-β1、α-SMA表达明显上调,BMP-7、E-cadherin表达明显下调,经尾静脉注射hUC-MSCs的大鼠,Snail1、TGF-β1、α-SMA表达明显下调,BMP-7、E-cadherin表达明显上调。以TGF-β1刺激RPMCs后,发现α-SMA、pSmad2的蛋白表达明显上调,E-cadherin明显下调,hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM进行干预后,α-SMA、pSmad2的蛋白表达明显下调,E-cadherin明显上调。结论我们利用组织贴块法自正常产妇脐带中成功分离出了hUC-MSCs。hUC-MSCs可以抑制MGO诱导的大鼠PF的发生,此作用可能是通过下调BMP-7,改善腹膜组织PMCs的上皮间充质转分化(EMT)实现的。体外实验,hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM可以有效抑制TGF-β1诱导的RPMCs的EMT,此作用是hUC-MSCs通过旁分泌机制抑制RPMCs TGF-β1/Smad2信号通路活性实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.5;R459.5

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本文编号：2418927