STRIP1和突变型STRIP1在小鼠足细胞中的作用机制研究

发布时间：2019-04-25 14:41

【摘要】：研究目的 我们曾获得一经临床及病理证实的家族遗传性局灶节段性肾小球硬化症（fami-lial focal and segmental glomerulosclerosis, FFSGS）大家系，在国家自然基金的资助下，对包括5代共54名成员在内的所有人员（未出现肾脏疾病的成员和FFSGS患者）进行连锁分析及全外显子测序（与深圳华大基因研究院合作），获得其致病基因为STRIP1（striatin interacting protein1）。并且经过初步体内实验发现在膜性肾病大鼠模型PHN、微小病变大鼠模型PAN这些典型足细胞病动物模型中，大鼠肾脏的strip1表达量增高，并且随建模时间的延长而增加。 为研究STRIP1是否与足细胞病变有关，是否会通过影响细胞形态和骨架结构导致足细胞功能的改变，我们以MPC（mouse podocyte clones，小鼠足细胞克隆）细胞系为基础，探究小鼠野生型Strip1在足细胞中的功能和突变型Strip1的致病机制。本实验将从足细胞形态、骨架和Strip1相关蛋白等方面研究Strip1的功能作用机制，为未来诊断和治疗相关的足细胞疾病提供新的思路和依据。 研究方法 通过构建Strip1基因沉默，野生型过表达和突变型过表达小鼠肾脏足细胞模型，研究Strip1在小鼠足细胞中的作用。实验设计如下：①针对小鼠Strip1基因设计干扰靶点、合成RNAi序列构建干扰腺病毒；②构建小鼠Strip1基因野生型和突变型过表达腺病毒；③用腺病毒感染完全分化成熟的MPC细胞，构建沉默、野生型和突变型过表达等细胞模型；④通过细胞免疫荧光、qPCR和western blotting观察Strip1基因的功能；⑤通过细胞免疫荧光、qPCR和western blotting观察突变型strip1在小鼠肾脏足细胞中的作用。 结果 成功构建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型和突变型过表达载体腺病毒：①所有构建载体（包括RNAi、野生型和突变型）的目的片段序列正确；②试感染MPC细胞，所有腺病毒均可表达，效果非常理想（P0.01）；③获得滴度高达1011TCID50/ml的三种目的腺病毒。 成功构建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型过表达足细胞模型，观察Strip1对小鼠足细胞的作用： 通过细胞免疫荧光观察，①strip1蛋白表达量降低时，细胞形态改变，边缘不规则，足突结构改变，外伸足突伸展不足。F-actin和α-tubulin分布紊乱；②当strip1蛋白表达量显著增高时，细胞变大变圆，边缘改变，足突结构破坏，伪足样足突伸展形态改变。F-actin明显边缘化，排列成了一个又大又圆的球形，边缘明亮，中间断续，α-tubulin完全失去了规则的排列方式；③Strip1表达量改变时，nephrin表达量变少；④ARP2和CTTNBP2的分布也发生了改变，部分strip1过表达细胞的细胞核变大变圆，ARP2在核周的分布形成了一个不完整的环形。 通过western blotting发现：在完全分化的终末分化MPC细胞中，①F-actin和α-tubulin表达量随strip1变化；②nephrin随Strip1变化表达量降低。 通过Real time PCR发现：F-actin和α-tubulin mRNA的变化与趋势相同（P＜0.05）。 成功构建突变型Strip1基因过表达足细胞模型，观察突变型Strip1对小鼠足细胞的作用： 通过细胞免疫荧光观察，①突变的strip1蛋白在细胞内表达，，细胞形态发生了明显改变，边缘伸展的足突结构异常，细胞边缘明显不规则。F-actin和α-tubulin的分布均随细胞形态的改变而化变，F-actin分布更加边缘化，α-tubulin也失去了正常的排列；②nephrin表达减少。 通过western blotting发现：突变细胞膜型中，①F-actin表达量增高；②nephrin表达量降低。 通过Real time PCR发现：F-actin mRNA的变化与趋势相同（P＜0.05），Arp2mRNA表达量降低（P＜0.05）。 结论 Strip1影响小鼠肾脏足细胞的骨架排列，它的异常会导致肌动骨架蛋白F-actin和微管蛋白α-tubulin的分布和表达异常，细胞正常形态消失，足突结构破坏，Strip1可能通过影响CTTNBP2的蛋白修饰影响细胞的骨架蛋白排列。且Strip1表达异常时，有F-actin支撑固定于裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丢失，从而导致足细胞功能的损伤。 突变型Strip1影响足细胞骨架结构和分布，细胞形态改变，足突结构消失，裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丢失。实验结果显示，发生突变的Strip1与F-actin相互作用，可能通过Arp2影响nephrin的表达。 综上所述，Strip1基因对维持足细胞正常形态和功能起重要作用，改变F-actin分布以致影响骨架分布，结构消失，使裂孔隔膜处锚定nephrin的丢失。该基因的此位点突变可能与足细胞病发生有关，且主要与足突结构消失和nephrin减少相关。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.6

【参考文献】

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本文编号：2465217