TUFM在膀胱癌中的表达及对T24细胞生物特性的影响

发布时间：2019-05-24 20:24

【摘要】：研究背景膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁人类健康。根据其浸润深度,主要分为浅表性膀胱癌及浸润性膀胱癌,其中尿路上皮癌约占90%[1]。膀胱肿瘤的治疗手段仍然采用手术为主放化疗为辅的治疗方案,但其疗效仍不确定,诊断为浸润性BCa患者术后2年内约有50%的患者出现复发、转移,5年生存率仅有27%-50%,因发生转移而未能及时手术切除,其中位生存期为7-20个月[2]。膀胱癌的早期诊断及术后复发成为影响治愈率及改善患者生活质量的关键因素。目前,评估膀胱癌患者肿瘤进展及预后主要是根据术后病理分级及临床分期[3]。然而,由于在相同病理分级及临床分期的膀胱癌患者中,呈现多样化的临床预后。这可能与肿瘤相关基因表达差异相关,而膀胱癌分子生物学的发展及靶向基因的发现将为膀胱癌提供新的治疗策略。通过对人体的遗传物质进行修正、补充或改造,即可达到治疗疾病的目的,即“基因治疗”(gene therapy)。随着遗传学和分子生物学的进展以及基因的发现,人类基因治疗已成为现实。在膀胱肿瘤基因治疗的研究上,人们也取得了许多重要的成果。近年来,线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu(mitochondrial Tu translation elongation factor, TUFM)在肿瘤发生进展中的作用及机制逐渐成为研究热点。运用蛋白质组学的方法,发现TUFM基因在人膀胱癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6-7]、结直肠癌[8]、食管鳞状细胞癌[9]、卵巢癌[10]等肿瘤细胞株或组织中呈高表达,其中TUFM的表达水平与胃癌及结直肠癌的临床分期和预后相关。TUFM蛋白在胃腺癌组织中不表达或低表达的患者临床分期一般较高,术后生存率较低,预后较差[8]；而结直肠癌组织中TUFM高表达的患者进展较快,5年内肿瘤复发率较高[9],提示在TUFM在不同肿瘤中表达不同,从而得出了不同的结论。尽管相关蛋白质组学研究发现TUFM蛋白在大部分肿瘤中呈高表达,并与胃癌和结直肠癌临床预后相关,但其在肿瘤发生进展中的作用机制及该蛋白对肿瘤细胞生物学特性的影响仍不清楚。而且,TUFM在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌细胞生物学功能特性的影响并不清楚。本研究首次探讨TUFM基因在膀胱癌中的表达,成功建立TUFM低表达细胞系,之后通过相关方法检测,进一步研究了沉默TUFM基因后对膀胱癌细胞株生物特性的影响。研究目的探讨TUFM基因在膀胱癌组织及细胞中的表达,探讨靶向沉默TUFM基因后对膀胱癌T24细胞生物功能的影响。方法本研究分为两部分：一、检测TUFM基因在膀胱癌组织及细胞中的表达 1. TUFM基因在膀胱癌患者组织标本中的表达检测膀胱癌及其配对癌旁正常组织来自在南方医院泌尿外科住院行TURBT或膀胱癌根治术的患者,经南方医院伦理委员会批准,获得患者知情同意。取得的膀胱上皮粘膜组织标本经南方医院病理科鉴定证实为膀胱尿路上皮癌组织,然后小组织放入冻存管,放入液氮后,-80℃冰箱保存备用。根据病理诊断分为浸润性尿路上皮癌组、高级别非浸润性尿路上皮癌组、低级别非浸润性尿路上皮癌组和癌旁组织组,应用免疫组化和实时定量PCR检测27例膀胱癌及癌旁组织中TUFM的表达水平,研究其与病理分级、临床分期之间的相关性。 2. TUFM基因在膀胱癌细胞及膀胱上皮永生化细胞中的表达检测收集两株人源膀胱癌细胞(T24、UMUC-3)和膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,用TRIzol提取总RNA,去DNA,逆转录,实时定量PCR检测三株细胞中TUFM的表达水平,比较两株人源膀胱癌细胞与膀胱上皮永生化细胞的表达差异,并据此选取细胞株进一步研究。二、沉默TUFM基因后对膀胱癌T24细胞生物功能影响的检测 1.TUFM基因低表达细胞系的建立及转染效率的检测。选取对数生长期的T24细胞株分为三组,分别为干扰组、阴性对照组、空白对照组,其中干扰组用RNAi的方法,应用脂质体Lipo2000,将特异性siRNA干扰片段转入细胞,沉默膀胱癌T24细胞TUFM基因的表达；阴性对照组细胞用相同方法转染阴性对照片段；空白对照组则不作任何处理。48小时后用实时定量PCR检测干扰及阴性对照组干扰片段的转染效率。 2.沉默TUFM基因后对膀胱癌T24细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的检测。 MTT法检测T24细胞的增殖。应用MTT实验检测三组细胞的抑制率,绘制细胞生长曲线,评价沉默TUFM基因后对T24细胞增殖能力的影响。划痕实验和Transwe11迁移实验检测各组细胞的迁移能力,评价沉默TUFM基因后对T24细胞迁移能力的影响。选用Annexin V-FITC细胞凋亡实验和DeadEnd TM比色法凋亡检测转染后T24细胞的凋亡。流式检测仪检测转染后T24细胞周期的影响。结果第一部分 1.共收集膀胱癌组织标本27例,浸润性尿路上皮癌组7例、高级别非浸润性尿路上皮癌组7例、低级别非浸润性尿路上皮癌组13例和癌旁组织组9例。全部标本均经南方医院病理科证实为膀胱尿路上皮癌,其中男性19例,女性8例,年龄32-81岁,中位年龄64岁。临床病理分期按国际抗癌联盟(UICC)中TNM标准：≤T1期：20例,T1期：7例。免疫组化的结果显示,与癌旁组织相比,膀胱癌组织中TUFM高表达,呈胞浆染色;TUFM的表达浸润性尿路上皮癌组高于非浸润性尿路上皮癌组,而且,高级别尿路上皮癌组高于低级别尿路上皮癌。荧光定量PCR结果显示组织中TUFM的mRNA水平随着膀胱癌组织的病理分级升高而升高,差异有统计学意义(P0.05),其中浸润性尿路上皮癌表达最高,癌旁组织组表达最低。 2.实时定量PCR结果显示,两株人源浸润性膀胱尿路上皮癌细胞株(T24、UMUC3)中TUFM基因表达明显高于膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1),差异有统计学意义(P0.05),其中T24细胞的TUFM基因表达量最高。第二部分 1.由于T24细胞的TUFM基因表达最高,我们选取T24细胞来研究TUFM基因对细胞生物特性的影响。选取对数生长期的T24细胞株分为三组,分别为干扰组、阴性对照组、空白对照组,应用脂质体法转染细胞后,将50umo1/L的特异性siRNA转染入T24细胞,48小时后,分别用实时定量PCR检测干扰及阴性对照组干扰片段的转染效率。结果显示：干扰组(si-TUFM组)的TUFM表达明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),阴性对照组与空白对照组之间的TUFM表达比较无显著差异,提示我们已经成功建立TUFM低表达膀胱癌细胞系 2.MTT法检测T24细胞的增殖能力结果显示,干扰组细胞增殖抑制率随着转染时间增加而增高,在转染后24h、48h、72h、96h,细胞增殖抑制率波动在9.5%±1.4%到22.7%±1.2%的范围。将50nmol/L的siRNA-TUFM和siRNA-NC干扰48小时后T24细胞划痕实验检测在0、12和24小时三个时间点观察三组细胞向中线迁移的距离及细胞数,观察TUFM沉默后在体外对细胞运动性的影响。结果显示干扰组细胞迁移能力明显降低,尤其是在划痕后24小时尤为明显。Transwell迁移模型是研究肿瘤细胞体外迁移能力最常用最经典的模型。利用Transwell迁移实验检测干扰后T24细胞的迁移能力,si-TUFM组透过Transwell小室胶质膜细胞数明显减少,细胞迁移能力明显下降。镜检计数,取上下左右中10个高倍视野计数膜背面的穿膜细胞进行统计,si-TUFM组从Transwell上室迁移过膜的每视野细胞数为43.1±9.4,阴性对照组每视野细胞数为222.2±26.1,空白对照组每视野细胞数为214.3±22.8,si-TUFM组染色细胞明显少于对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05),三组细胞干扰后72小时候,显微镜下拍照见干扰组细胞密度明显减少,细胞体积缩小,死细胞明显增多。进一步行DeadEnd TM比色法凋亡检测结果显示干扰组呈棕褐色的细胞明显多于阴性对照组和空白对照组,DeadEndTM比色法凋亡检测系统可以对凋亡细胞的降解DNA进行末端标记,该系统以改进的TUNEL方法为基础(TUNEL为TdT介导的dUTP缺口末端标记法)。Annexin V-FITC细胞凋亡实验结果显示,干扰组凋亡率为19.5%±3.9%,明显高于阴性对照组5.8%±1.8%和空白对照组2.09%±1.1%(P0.05),阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义。细胞周期阻滞实验结果显示三组间细胞的细胞周期未见明显差异。结论 TUFM的表达在浸润性尿路上皮癌组高于非浸润性尿路上皮癌组,而且,高级别尿路上皮癌组高于低级别尿路上皮癌,TUFM的表达随着膀胱癌组织的病理分级升高而升高。浸润性膀胱癌细胞株的TUFM表达明显高于正常膀胱上皮细胞。沉默TUFM基因后,细胞增殖能力下降、迁移能力减低、细胞诱导凋亡增加。TUFM基因可能与膀胱癌的发生与进展相关,TUFM或许可作为膀胱癌基因治疗的基因靶点。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.14

【参考文献】