长链非编码RNAs调控草酸钙结晶肾损伤的作用及机制研究

发布时间：2019-08-14 10:03

【摘要】：【背景】肾结石是梗阻性肾病常见原因之一,其发病率每年攀升。肾结石是微结晶集聚组成的,其中80%是草酸钙。草酸钙结晶肾小管上皮细胞损伤是肾结石的早期表现,是同一疾病不同发展阶段。因此研究肾结石靶定在早期阶段有助于预防疾病的发生。结晶在肾小管的沉积会导致急性肾损伤,最终进展为终末期肾病。伴随肾功能下降的肾结石患者发生肾间质纤维化,这一过程是多数肾脏疾病最终病理结果。大量研究表明肾间质纤维化常可引起肾脏上皮细胞表型逐渐转化为间质细胞表型,就是所谓上皮间质转分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)。文献报道,上皮间质转分化可能与细胞增殖是相关的。例如:在体外,TGF-β1刺激小鼠肾小管上皮细胞抑制在G2/M期和产生能够促使周细胞转化为成纤维细胞的促纤维化细胞因子。在体内肾脏纤维化小鼠模型中,上皮间质转分化是纤维化损伤的启动因素,抑制细胞周期在G2期。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是近年来学者们争相研究热点,它是非编码RNAs的一种类型,长度超过200个核苷酸(Nucleotides,nt),几乎没有编码蛋白质能力。研究表明lncRNAs在生物学进程中扮演重要角色,如调控细胞分化、增殖、凋亡等。此外,人类很多疾病中发现lncRNAs表达异常并且参与疾病进展,例如直肠癌,前列腺癌,肾癌,梗阻性肾病。目前,lncRNAs在肾结石领域研究甚少,而EMT是肾结石伴随肾间质纤维化关键启动因素之一。提出假设lncRNAs是通过调节EMT影响肾结石发生发展。本课题应用lncRNAs和m RNAs芯片检测正常小鼠肾组织和结晶组小鼠肾组织中lncRNAs和m RNAs表达谱差异。通过人鼠同源性对比,筛选出人的lncRNAs及其可能调控基因,并进一步探讨其在肾结石中作用和机制,为将来深入研究提供理论基础。【目的】利用基因芯片和人鼠同源性分析筛选确定lncRNA-CHCHD4P4。探讨CHCHD4P4在结晶肾损伤过程中的生物学功能和分子调控机制,为将来临床防治肾结石提供分子靶点。【方法】1.用Agilent 8×60K小鼠全基因组芯片对3只结晶组和3只对照组小鼠肾组织进行m RNAs和lncRNAs差异基因筛选,差异基因表达分析中采用Limma算法,筛选条件是Fold Change1.5,P0.05。基于差异m RNAs做了基因功能分析(GO)及信号通路分析(KEGG Pathway),得到显著上调的GO-Term和显著下调的GO-Term及其包含的基因,及显著上调的Pathway和显著下调的Pathway及其包含的基因。2.采用人鼠同源性序列比对,获得与鼠同源性人的lncRNAs。采用Real-time PCR(RT-PCR)技术,在一水草酸钙(COM)刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)体外模型中验证CHCHD4P4表达水平。3.CHCHD4P4体外功能研究:选用HK-2细胞作为研究对象,转染CHCHD4P4 Si RNA抑制CHCHD4P4表达水平或者转染CHCHD4P4-pc DNA3.1过表达CHCHD4P4表达水平。体外分别用实时定量PCR(RT-PCR),免疫荧光,免疫印迹法检测上皮间质标志物。对于细胞增殖和凋亡生物学行为采用CCK8,Edu,流式细胞仪等检测。【结果】1.微阵列芯片结果显示差异表达lncRNAs共376条,其中结晶组表达上调154条,下调222条;差异表达m RNAs共2165条,上调1421条,下调744条。2.人鼠同源性筛选出15对,RT-PCR验证获得人源lncRNA是CHCHD4P4,鼠源lncRNA是AU015836,二者在结晶组模型中均高表达。3.在体外模型中,CHCHD4P4相对对照组高表达。结晶组上皮表型E-cadherin表达减少,而间质表型vimentin,snail,ZEB1表达增加。同时结晶组细胞增殖能力减弱,凋亡水平增强,而细胞周期基本没有变化。【结论】1.在体外,COM刺激HK-2细胞模型中发生EMT现象,与前期我们团队乙醛酸盐诱导小鼠结晶肾损伤模型结果一致。2.结晶组相对对照组,CHCHD4P4高表达。CHCHD4P4 Si RNA可减弱上皮细胞表型向间质表型转变过程,而CHCHD4P4-pc DNA3.1可加快EMT发生。3.在结晶组,CHCHD4P4可抑制细胞增殖能力,促进细胞凋亡,不改变细胞周期。4.在结晶肾损伤模型中,CHCHD4P4可能通过促进上皮间质转分化抑制细胞增殖,促进凋亡。CHCHD4P4可能是肾结石发生和发展过程中重要的调控分子。
【图文】：

（一）成功构建小鼠结晶肾损伤模型在显微镜下，CONTROL组没有黑色钙盐沉积，而CAOX组小鼠皮髓交界处有黑色钙盐沉积（见图1-1）。且半定量草酸钙结晶评分显示，CAOX组评分高于CONTROL组（见图1-2）。以上结果表明小鼠结晶肾损伤模型构建成功。图1-1小鼠肾组织草酸钙结晶沉积（50×）（CONTROL VS CAOX）图1-2结晶组和对照组肾脏组织钙盐沉积评分注：***P<0.001

在显微镜下，，CONTROL组没有黑色钙盐沉积，而CAOX组小鼠皮髓交界处有黑色钙盐沉积（见图1-1）。且半定量草酸钙结晶评分显示，CAOX组评分高于CONTROL组（见图1-2）。以上结果表明小鼠结晶肾损伤模型构建成功。图1-1小鼠肾组织草酸钙结晶沉积（50×）（CONTROL VS CAOX）图1-2结晶组和对照组肾脏组织钙盐沉积评分注：***P<0.001
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.4

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本文编号：2526500