【摘要】：背景 肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是发生于肾实质肾小管上皮(renal tubule epidermis)的恶性肿瘤,约占成人肾脏恶性肿瘤的90-95%。在世界范围内,每年由肾细胞癌导致的死亡人数已经超过100,000。大约25-30%的肾细胞癌患者初次就诊时已发生转移,约1/3的局限性肾癌患者手术切除肿瘤后会发生转移,转移性肾癌患者的5年生存率约为5%-10%。在临床上手术切除肿瘤是治疗局限性肾细胞癌的首选方式,但是对于转移性肾癌患者手术治疗效果甚微。而且传统的化疗和免疫治疗对于晚期肾癌患者的治疗效果不佳。近期兴起的肾细胞癌的靶向药物治疗发展比较迅速,在所有一线肾细胞癌靶向治疗药物中最具代表性的就是舒尼替尼和替西罗莫司,它们分别可以阻断受体酪氨酸激酶(RTKs)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),但是这些靶向药物有效率不高,而且价格昂贵。因此我们需要探寻一些价格低廉,而且高效的药物去抑制晚期肾癌发展。 他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,在临床广泛的应用于脂代谢异常的病人,可以有效降低胆固醇水平。近期大量研究表明,他汀类药物具有抑制多种肿瘤进展的作用。目前大量临床试验也对他汀类药物的抗肿瘤作用进行深入研究,而且他汀类药物的安全性已经被大量的实验数据证实。总体来说他汀类药物是一个大家族,包括洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀和阿托伐他汀等等。在他汀类药物家族中,普伐他汀已经证实对于癌细胞不发挥任何作用,但是其他他汀类药物具有广泛的抗癌作用。不同他汀类药物抗癌效能不同,或许跟他汀类药物不同的化学结构相关。尤其跟药物的亲水性或者亲脂性相关,亲脂性的他汀类药物易于突破细胞膜发挥生物学作用。所以我们选取亲脂性能较好而且临床广泛应用的他汀类药物辛伐他汀,研究它在抑制肾癌细胞生物学行为中的作用。辛伐他汀是一种羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,可以竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶,阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径,使细胞内胆固醇合成减少。此外辛伐他汀还具有抗炎,调控免疫,有效的降低老年痴呆的风险,减少蛋白尿以减缓肾脏疾病的进展的作用。而且更加具有意义的是,越来越多的实验数据证明辛伐他汀药物具有广泛的抗癌作用,包括前列腺癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌等。到目前为止还没有辛伐他汀对肾癌细胞增殖和转移等生物学行为的研究报道。辛伐他汀对于肾癌细胞中与肾癌发生发展密切相关的AKT/mTOR, ERK, JAK2/STAT3和凋亡相关的信号通路的影响尚未明确。所以本课题第一步分就辛伐他汀对于肾癌细胞的生物学作用以及作用相关的分子机制进行了深入研究。 两面针碱是从芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取的一种生物碱。早期的研究表明,两面针碱具有抗炎,抗真菌,抗氧化,甚至具有抗艾滋病的功能。氯化两面针碱(Nitidine chloride)是两面针碱的一种氯化形式,同时实验研究发现,氯化两面针碱能够抑制体外培养的骨肉瘤细胞、胃癌细胞和肝癌细胞的增殖,并且诱导肿瘤细胞的凋亡。上述研究提示辛伐他汀和氯化两面针碱对肾癌的防治可能有意义。但目前关于氯化两面针碱对肾癌细胞生物学行为影响的研究尚未有报道。氯化两面针碱对肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学行为有无影响,以及氯化两面针碱的抗癌作用所通过的信号通路尚未明确明。所以在本课题第二和第三部分就氯化两面针碱在肾癌细胞中抑制转移和诱导凋亡作用以及相关的信号通路进行深入研究。 鉴于目前对于晚期肾癌治疗的困境,辛伐他汀和氯化两面针碱作为一种廉价而且安全的药物,研究其对肾癌细胞生物学行为可能影响,将是非常有意义的工作。 目的 本研究以肾透明细胞癌786-0和A498细胞为模型,探讨新型抗肿瘤药物辛伐他汀和氯化两面针碱对786-0和A498细胞活力,凋亡及侵袭和转移等生物学行为的影响,并进一步研究药物对细胞内MAPK, AKT/mTOR和JAK2/STAT3通路活性的影响,以寻找治疗肾癌的有效药物。 方法 运用细胞活力检测试验(MTT assay),克隆形成(Colony formation assay)和流式细胞凋亡检测试验(Flow cytometric apoptosis assays)检测辛伐他汀对于肾癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。运用划痕试验(Scratch migration assay)和Transwell侵袭迁移实验(Transwell invasion and migration assay)检测了辛伐他汀与肾癌细胞迁移和侵袭的关系。通过裸鼠荷瘤试验检测辛伐他汀对于肾癌细胞体内增殖的抑制作用。应用免疫印迹试验(Weston blot)检测辛伐他汀对于肾癌细胞中凋亡相关蛋白以及AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路的影响。 运用细胞活力检测试验(MTT assay)和流式细胞凋亡检测试验(Flow cytometric apoptosis assays)检测氯化两面针碱对于肾癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。运用划痕试验(Scratch migration assay)和Transwell侵袭迁移实验(Transwell invasion and migration assay)检测了氯化两面针碱与肾癌细胞迁移和侵袭的关系。通过裸鼠荷瘤试验检测氯化两面针碱对于肾癌细胞体内增殖的抑制作用。应用免疫印迹试验(Weston blot)检测氯化两面针碱对于肾癌细胞中凋亡相关蛋白,基质金属蛋白酶家族(MMPs)以及AKT和ERK通路的影响。 结果 通过MTT检测细胞活力试验发现辛伐他汀可以明显抑制A498和786-0细胞的增殖,并且具有时间和剂量依赖性。克隆形成试验提示辛伐他汀可以明显抑制A498和786-0细胞的克隆形态和克隆数量。辛伐他汀可以明显抑制肾癌细胞在裸鼠皮下的增殖,并且可以诱导体内癌细胞的凋亡。我们进一步检测了辛伐他汀处理的肾癌细胞中凋亡相关蛋白表达的变化,辛伐他汀可以激活肾癌细胞中的c1eavage-Caspas e-3n cleavage-PARP和Bax,抑制Survivin和Bcl-2的表达。在我们实验中,未发现辛伐他汀对于肾癌细胞周期有明显的影响。通过细胞划痕试验和Transwell试验发现辛伐他汀可以明显抑制A498和786-0细胞的迁移和侵袭。在分子机制方面,我们应用Western blot检测辛伐他汀在A498和786-0细胞中对于AKT, mTOR, ERK, JAK2和STAT3的磷酸化的影响。在体内实验和体外实验中我们应用辛伐他汀处理肾癌细胞可以降低磷酸化ERK。我们进一步应用siERK1/2敲除ERK1/2,然后应用辛伐他汀处理肾癌细胞可以明显抑制肾癌细胞的增殖和转移,这表明干扰ERK1/2的表达可以促进辛伐他汀的抵抗肾癌的作用。我们进一步检测辛伐他汀对肾癌细胞中AKT/mTOR通路的影响,我们在A498和786-0细胞中发现AKT/mTOR高表达。应用辛伐他汀处理肾癌细胞后可以明显抑制AKT和mTOR的磷酸化。我们进一步应用siAKT敲除AKT,然后应用辛伐他汀处理肾癌细胞可以明显抑制肾癌细胞的增殖和转移,这表明辛伐他汀可以通过抑AKT抑制肾癌进展,干扰AKT的表达可以促进辛伐他汀的抵抗肾癌的作用。我们首次发现辛伐他汀可以抑制IL-6介导的肾癌细胞的增殖和转移,抑制IL-6激活的JAK2/STAT3通路的磷酸化。我们进一步应用siSTAT3敲除STAT3,然后应用辛伐他汀处理肾癌细胞可以明显抑制肾癌细胞的增殖和转移,这表明辛伐他汀可以通过抑STAT3抑制肾癌进展,干扰STAT3的表达可以促进辛伐他汀的抵抗肾癌的作用。综合数据表明,辛伐他汀可以通过AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路抑制肾癌细胞的增殖和转移。 MTT细胞活力检测显示氯化两面针碱可以明显抑制786-0和A498细胞的增殖,并且具有时间和浓度依赖性。通过流式细胞技术检测发现氯化两面针碱可以明显诱导786-0和A498细胞的凋亡,并且具有浓度依赖性。氯化两面针碱可以明显抑制肾癌细胞在裸鼠皮下种植的增殖,并且可以明显诱导肾癌细胞在体内的增殖。在分子机制方面,氯化两面针碱可以激活786-0和A498细胞中P53, Bax, cleavage-caspase-3和cleavage-PARP的表达,可以抑制Bcl-2, caspase-3和PARP的表达。我们进一步探究氯化两面针碱对于肾癌细胞中通路的影响,发现氯化两面针碱可以抑制ERK1/2的磷酸化。应用ERK1/2抑制剂PD98059发现抑制ERK1/2可以增强氯化两面针碱对于肾癌细胞增殖的抑制作用。综上所述,氯化两面针碱可以通过ERK通路发挥抵抗肾癌的作用。 通过细胞划痕实验发现氯化两面针碱可以明显抑制786-0和A498细胞的迁移。通过Transwell试验检测发现氯化两面针碱可以明显抑制786-0和A498细胞的侵袭和迁移。在分子机制方面,氯化两面针碱可以抑制786-0和A498细胞中AKT的磷酸化,而且同时可以抑制MMP-2的MMP-9表达。应用AKT特异性抑制剂LY294002抑制AKT的表达合并应用氯化两面针碱可以增强对肾癌细胞迁移的抑制作用。综上,我们发现氯化两面针碱可以通过AKT通路抑制肾癌细胞的转移。 结论 通过体内和体外实验发现辛伐他汀可以明显抑制肾癌细胞的增殖并且可以诱导肾癌细胞的凋亡,通过体外细胞划痕和Transwell实验发现辛伐他汀可以明显抑制肾癌细胞的侵袭和转移。而且辛伐他汀可以而且辛伐他汀可以通过AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路发挥抑制肾癌的作用。为辛伐他汀的抗肿瘤效应提供新的证据,为晚期肾癌的治疗提供了新的策略。 氯化两面针碱可以抑制肾癌细胞在体内和体外的增殖,而且氯化两面针碱可以通过ERK通路发挥抑制肾癌增殖的作用。而且氯化两面针碱可以明显抑制肾癌细胞在体外的转移,并且可以通过AKT通路发挥抑制肾癌转移的作用。为氯化两面针碱的抗肿瘤作用提供新的依据,而且表明氯化两面针碱可以作为一种潜在的治疗晚期肾癌的策略。 本研究创新点 1.首次发现辛伐他汀可以通过抑制IL-6介导JAK2/STAT3通路发挥抑制肾癌细胞增殖和转移的作用。 2.首次发现应用氯化两面针碱可以通过可以通过抑制AKT通路发挥抑制肾癌细胞的侵袭和转移的作用。 3.首次发现氯化两面针碱可以通过抑制ERK通路发挥抑制肾癌细胞的增殖和诱导肾癌细胞的凋亡的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11
【共引文献】
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本文编号：
2529448
