经肾动脉移植脂肪干细胞对大鼠急性缺血性肾损伤的治疗作用研究
发布时间：2019-09-18 20:48
【摘要】：第一部分SD大鼠脂肪干细胞分离培养鉴定及大鼠急性缺血性肾损伤模型的建立目的：脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ASCs)分离培养和鉴定：建立大鼠急性缺血性肾损伤(ischemic acute kidney injury)模型。方法：采用Ⅰ型胶原酶消化法获取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪组织中的ASCs,贴壁法纯化,倒置显微镜下观察细胞形态及生长过程,取第3代细胞用于实验。体外标准诱导下检测此类细胞成脂、成骨等多向分化能力,并以FCM仪检测其表面标志物CD29、CD90、CD34和CD45。以无创动脉夹持续夹闭双侧肾蒂45min的方法建立大鼠iAKI模型,并检测正常大鼠和iAKI大鼠再灌注24hr时的血肌酐(Scr)。结果：1.原代细胞呈短梭形或小多角形,贴壁集落生长,贴壁细胞经3次传代后,细胞大小及形态趋于一致,呈长梭形旋涡状、放射状生长。2.FCM鉴定ASCs细胞表面抗原,结果显示CD29和CD90高表达,CD34和CD45低表达,符合ASCs公认的免疫表型；在标准成脂诱导条件下,油红O染色可见脂肪滴证实其可向脂肪细胞分化；在标准成骨诱导条件下,Von Kossa染色可见矿化结节证实其可向成骨细胞分化。3ASCs传至第9代仍可保持平均每天1.33×104个的增值速度。4.正常大鼠血肌酐为41.67±5.92μmol/L, iAKI大鼠再灌注24hr时的血肌酐为261.99±5.09μmol/L。结论：1.通过Ⅰ型胶原酶消化法可获得较高纯度的大鼠ASCs,细胞贴壁生长并且高表达CD29和CD90,低表达CD34和CD45,符合公认的ASCs免疫表型。2.分离获得的ASCs在标准诱导条件下可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞,多向分化潜能证实其为干细胞。3.大鼠腹股沟处皮下脂肪组织中提取的ASCs自我更新能力旺盛,传至第9代仍可保持较快增殖速度。4. iAKI大鼠24hr时血肌酐较正常大鼠显著升高(P0.05),iAKI模型建立成功。第二部分经左侧肾动脉移植ASCs对大鼠急性缺血性肾损伤的治疗作用研究目的：探讨经左侧肾动脉移植ASCs对大鼠急性缺血性肾损伤(iAKI)的治疗作用。方法：持续夹闭SD大鼠双侧肾蒂45min建立iAKI模型。将建模成功后的SD大鼠随机分成两组：对照组(再灌注后即刻经左肾动脉注射500μ1PBS, n=30)、ASCs治疗组(再灌注后即刻经肾动脉移植5x105 ASCs, n=30)。术后12、24、48、72hr和1wk时处死大鼠,取血、分离血清,分别测定血清肌酐值,光学显微镜观察肾脏病理损伤及细胞凋亡、炎症反应及细胞增生情况,并进行肾小管间质损伤评分和统计学分析。结果：1ASCs治疗组Scr水平在各时间点均显著低于对照组(P0.05)。2.肾脏病理及肾小管间质损伤评分提示：与对照组相比,治疗组再灌注12、24和48hr时损伤显著减轻。3.与对照组相比,治疗组左侧肾脏TUNEL染色和巨噬细胞浸润染色积分再灌注12、24、48、72hr和1wk时显著降低(P0.05)；核增殖抗原48hr时显著增加(P0.05),72hr和1wk时减少(P0.05)。与治疗组右侧肾脏相比,治疗组左侧肾脏于再灌注后24hr肾小管间质损伤评分显著降低(2.40±0.50,P0.05),再灌注后1wk时,肾组织TUNEL染色阳性细胞数减少(P0.05),再灌注12、48、72hr和1wk时巨噬细胞浸润染色积分减少(P0.05),再灌注后48hr时核增殖抗原表达增加(P0.05),再灌注后72hr和1 wk时核增殖抗原表达减少(P0.05)。结论：ASCs经肾动脉移植可显著改善iAKI大鼠肾功能、减轻肾脏病理损伤和细胞凋亡、减少炎症细胞浸润、促进损伤后修复。此外,直接移植ASCs的左肾在细胞凋亡、炎症细胞浸润、损伤修复方面均优于右肾,提示ASCs进入受损部位或受损附近部位后发挥了重要作用。第三部分经左侧肾动脉移植后的ASCs在AKI大鼠体内分布情况研究目的：研究标记后的ASCs经大鼠左侧肾动脉移植后在AKI大鼠体内分布情况。方法：选择CM-Dil标记ASCs,荧光倒置显微镜观察细胞染色情况。参照第二部分方法制作大鼠iAKI模型,再灌注后即刻经左肾动脉移植5×105 CM-Dil标记的ASCs,术后12、24、48、72hr和1wk时处死大鼠,制作冰冻切片,DAPI标记细胞核,荧光倒置显微镜观察肾、肺、肝、脾、心脏内的CM-Dil阳性细胞的分布情况,并计数不同时间点双侧肾脏单个肾小球内平均ASCs数量。结果：1ASCs肾内分布情况：CM-Dil阳性细胞主要分布于左侧肾小球内,其中移植后12hr和24hrASCs较多,48hr、72hr和1wk时ASCs数量逐渐减少：右肾所有时间点均未观察到CM-Dil阳性细胞。2.ASCs在肺、肝、脾、心脏的分布情况：48hr、72hr时肺内存在少量CM-Dil阳性细胞,12hr、24hr、1wk时未观察到CM-Dil阳性细胞；48hr肝内存在少量CM-Dil阳性细胞,其他时间点未观察到CM-Dil阳性细胞：脾脏和心脏在各时间点均未观察到CM-Dil阳性细胞。2.12hr、24hr、48hr、 72hr、1wk时单个肾小球内CM-Dil阳性细胞计数分别为：6.33+1.75、5.67±1.15、4.5±1.05、3.43±1.06、2.5±1.29个。结论：1.选择CM-Dil标记ASCs,进行体内示踪并观察其分布情况是可行的。2.经左侧肾动脉移植的ASCs全部分布在左侧肾小球内,右侧肾小球在各个时间点均未观察到CM-Dil阳性细胞。3.肾动脉移植途径可有效减少ASCs在其他脏器的滞留,提高归巢率,发挥治疗作用。
【图文】：
细胞形状也由原来的梭形变为类圆形或多角形，，随诱导时间的延长，逡逑出现脂滴的细胞逐渐增多。诱导８ｄ后，细胞体积增大，胞浆内充满圆形脂滴，呈逡逑葡萄串状（图１－３Ａ）。这时进行油红０染色可见：圆形细胞内出现亮红色的颗粒，逡逑证明胞浆内容物确为脂肪滴（国１－３Ｂ）。对照纽无明显变化，仍为梭形细胞，未逡逑见胞浆内脂滴。逡逑４．逦ＡＳＣｓ的成骨诱导逡逑成骨诱导：１８ｄ后，倒置显微镜下观察可见部分细胞形态发生明显变化，由梭逡逑形转化为多角形，且胞体增大，突起增多，胞核变大变圆，胞浆中可见细小黑色逡逑颗粒．细胞常围绕集落中央呈岛状分布烟１－４Ａ）。取成骨诱导１８ｄ的细施经Ｖｏｎ逡逑Ｋｏｓｓａ染色可见：在集落生长的细胞团中央区，细胞外基质中出现掠黑色团块状逡逑x锼嵫纬恋恚纯蠡峤冢ㄍ迹保辞伞６哉兆椋郑铮铄澹耍铮螅螅崛旧跣浴ｅ义希担
本文编号：2537703
【图文】：
细胞形状也由原来的梭形变为类圆形或多角形，，随诱导时间的延长，逡逑出现脂滴的细胞逐渐增多。诱导８ｄ后，细胞体积增大，胞浆内充满圆形脂滴，呈逡逑葡萄串状（图１－３Ａ）。这时进行油红０染色可见：圆形细胞内出现亮红色的颗粒，逡逑证明胞浆内容物确为脂肪滴（国１－３Ｂ）。对照纽无明显变化，仍为梭形细胞，未逡逑见胞浆内脂滴。逡逑４．逦ＡＳＣｓ的成骨诱导逡逑成骨诱导：１８ｄ后，倒置显微镜下观察可见部分细胞形态发生明显变化，由梭逡逑形转化为多角形，且胞体增大，突起增多，胞核变大变圆，胞浆中可见细小黑色逡逑颗粒．细胞常围绕集落中央呈岛状分布烟１－４Ａ）。取成骨诱导１８ｄ的细施经Ｖｏｎ逡逑Ｋｏｓｓａ染色可见：在集落生长的细胞团中央区，细胞外基质中出现掠黑色团块状逡逑x锼嵫纬恋恚纯蠡峤冢ㄍ迹保辞伞６哉兆椋郑铮铄澹耍铮螅螅崛旧跣浴ｅ义希担
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