NOB1基因在人高侵袭性前列腺癌细胞生物学中的作用研究

发布时间：2019-10-13 13:25

【摘要】：一、研究目的：前列腺癌是全球中老年的常见恶性肿瘤，占全球范围男性癌症发病率的第二位，病死率则位居全球肿瘤的第六位。据报道，在欧洲每年有超过30万的男性确诊为前列腺癌。在美国，，男性好发的恶性肿瘤中，前列腺癌稳居第一位，病死率占男性癌症死亡率的第二位。我国前列腺癌的发病率和死亡率较低，但近年来前列腺癌的发病率明显上升，近年的一些研究报道提示，上海地区前列腺癌以7.7/10万的高发病率位居我国男性泌尿系肿瘤第一位。为此，前列腺癌已然成为当今人们密切关注的疾病，同时也成为泌尿外科研究领域的一大热点。当今，去势治疗仍是治疗前列腺癌的标尺。无论手术去势还是药物去势均能达到大量杀死肿瘤细胞的效果，延缓前列腺癌的进展。但一项研究表明，进过治疗后18~24个月，几乎所有前列腺癌病人将由雄激素依赖型转变为高侵袭性的去势抵抗型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）。而其中很大一部分患者是在进行二线激素治疗的过程中逐渐发展为高侵袭激素抵抗型前列腺癌的，对于该种病人，目前仍缺少有效可行的治疗方案。 NOB1蛋白（Nin one binding-1protein）是一种核糖体装配蛋白，亦可以称为捙带蛋白，最早利用酵母双杂交的方法发现于酿酒酵母菌26S蛋白酶体中。NOB1在真核生物的溶酶体合成以及核糖体形成过程中发挥着重要的作用。人类的NOB1基因包含9个外显子和8个内含子，位于16号染色体长臂22.1位点上；它的cDNA长约1749bp，其开放阅读框（open reading frame, ORF）位于33nt～1271nt。NOB1蛋白由总分子量约为46KDa的412个氨基酸组成。其N端存在一个由100个氨基酸构成PIN（PiLT amino terminus）结构，C端的第208～296位氨基酸则形成一个锌带结构域（zinc ribbon domain）。两种结构域各司其职，他们分别在细胞内核糖体蛋白形成、分解以及基因转录过程中发挥不可小觑的作用。 NOB1蛋白在人类多种器官组织中均可见表达，但表达量各异，例如其在成人脾脏、肝和肺中含量最高，而在肾脏、前列腺、卵巢以及结肠中则表达较少。近年的一些研究提示，NOB1参与很多恶性肿瘤的发生发展，人为的敲除NOB1基因后能够阻碍一些肿瘤细胞的增殖生长，如肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌肿瘤、甲状腺乳头状癌、人胶质瘤和非小细胞肺癌等，但有关NOB1对前列腺癌细胞，尤其对高侵袭性前列腺癌细胞（如PC-3和DU145）生长及相关调控机制的研究至今少之又少。鉴于慢病毒载体的种种优点，我们前期成功构建了靶向敲减NOB1基因的shRNA慢病毒载体。并通过该载体研究NOB1表达水平的变化对高侵袭性前列腺癌细胞生物学行为的影响，并为将来从NOB1靶向分子方向入手治疗前列腺癌奠定了结实的基础。二、研究内容及结果：（一）前列腺癌组织的各细胞系中NOB1的表达情况为研究NOB1基因在前列腺癌中的功能，我们将抗-NOB1的抗体注入前列腺癌组织和邻近正常组织中。与正常组织相比较，前列腺癌组织有着强烈的NOB1抗体的着色现象。q-PCR技术检测7对前列腺癌组织中NOB1的水平，结果显示，前列腺癌组织中NOB1的水平较正常组织有着显著的增高现象。之后，我们对前列腺癌的各细胞系进行了分析。DU145、PC-3和22RV1细胞系中NOB1的表达水平明显高于雄激素敏感型的LNCap细胞系，其中LNCap侵略性和恶性程度较其他三种细胞系低。这些结果提示我们，NOB1基因与前列腺癌细胞的发生发展存在一定的联系，为后续进一步研究NOB1对高侵袭性前列腺癌细胞（PC-3和DU145）的影响奠定基础。（二）NOB1基因在高侵袭性前列腺癌细胞中的敲减效率前期工作中，我们成功构建了靶向沉默NOB1基因的shRNA慢病毒，然后我们挑选上述NOB1表达水平相对高的PC-3和UD145细胞，用已经构建好的慢病毒对两种前列腺癌细胞进行感染。转染72小时后，我们通过绿色荧光蛋白（GFP）将慢病毒对两种细胞的感染效率形象的表达出来。另外，我们分别利用蛋白印记（western blot）和qPCR技术对NOB1基因的敲减效率进行蛋白水平和mRNA水平的分析，结果显示shRNA慢病毒载体明显下调了PC-3和DU145细胞中NOB1的表达。（三）敲减NOB1基因对前列腺癌细胞PC-3和DU145的生长增殖、克隆形成能力、细胞周期及细胞迁移能力的影响在我们主要的实验部分，我们通过慢病毒载体下调NOB1基因，来研究NOB1基因对高侵袭性前列腺癌肿瘤细胞生物学方面的影响。首先我们选择PC-3和DU145前列腺癌细胞株，对经Lv-shNOB1转染后的PC-3和DU145细胞进行MTT细胞增殖实验。和对照组Lv-shcon转染的细胞相比，Lv-shNOB1转染的两组细胞的生长明显受到抑制。为了评估NOB1在细胞集落形成中的功能，我们用Lv-shNOB1转染PC-3和DU145两种细胞，并将它们置入6孔板中培养。15天后，培养出的克隆体用姬姆萨固定并着色。与对照组相比较，沉默NOB1基因导致集落形成体积变小、分散且成团能力差。根据细胞周期各阶段所含不同含量的DNA来对细胞周期分布进行测定，我们利用流式细胞技术来进一步分析NOB1在细胞周期进程中的功能作用。和对照组对比，PC-3和DU145细胞中Lv-shNOB1组发生G0/G1期阻滞现象。另外，在S期两种细胞的比例明显减少。该结果表明，敲减NOB1会影响细胞周期进程，进而抑制细胞的增殖生长。最后，我们还设计了细胞迁移实验，来研究敲减NOB1基因是否会对高侵袭性前列腺癌细胞的迁移能力产生影响。结果发现，沉默NOB1基因后，PC-3和DU145两种细胞的迁移能力明显受到抑制。三、结论：综上所述，为了阐明NOB1在人类前列腺恶性肿瘤中的功能作用，我们对前列腺癌细胞中NOB1的表达水平进行了分析，并发现NOB1在前列腺癌细胞组织中的表达水平明显高于相邻正常组织。之后通过创建沉默NOB1基因的shRNA慢病毒载体高效率感染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和DU145，并进行细胞增殖、克隆形成、细胞周期及细胞迁移等实验，我们发现低表达NOB1会导致前列腺癌细胞的细胞周期调控紊乱、细胞增殖生长及克隆能力抑制，以及细胞的流动性降低等现象。因此，NOB1对前列腺癌的成瘤过程起着正相关作用。鉴于前列腺癌性质转变的机制尚不清楚，NOB1有可能成为将来抑制并治疗高侵袭性前列腺癌疾病的一种新的靶向分子。
【图文】：

前列腺癌,肿瘤组织,表达水平

- 17 -图 1B，qRT-PCR 检测前列腺癌及其癌旁组织中 NOB1 表达情况（P<0.01）结果显示，与癌旁邻近组织（Adjacent）比较，肿瘤组织（Pca）NOB1 表达水平显著升高，P<0.01。

前列腺癌,免疫组化,侵袭性,技术检测

NOB1 基因在人高侵袭性前列腺癌细胞二、实验结果（一） NOB1 在前列腺癌与癌旁组织中的表达情1.免疫组化及 qRT-PCR 技术检测前列腺组织中 NOB
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】