TXNIP在糖尿病肾组织脂质沉积中的作用及机制研究

发布时间：2019-11-25 19:28

【摘要】：目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病所致的全身微血管病变的肾脏表现,主要以肾小球系膜细胞增生及细胞外基质沉积,肾小管上皮细胞凋亡及转分化,肾小球硬化和间质纤维化为主要病理特征。DN的发病机制非常复杂,一直是国内外肾脏病学领域研究的重点。过去十年的研究发现,肾脏固有细胞的脂质代谢紊乱是糖尿病肾损伤发生的重要病理生理基础。高糖状态下脂质成分在肾细胞内异常沉积,可造成肾细胞的慢性功能紊乱和细胞损伤。用基因学或药学方法干预糖尿病动物模型体内脂质生成基因的表达,如固醇调节因子结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBPs)及过氧化物酶增殖活化受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR),可改善糖尿病引起的肾脏损伤,说明脂质代谢紊乱在DN发病过程中发挥了关键作用。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein,TXNIP)或硫氧还蛋白结合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2,TBP-2),又称维生素D3上调蛋白1(vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1)是一种内在的硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)调节蛋白,其可与Trx结合而抑制其功能,从而诱导细胞发生过氧化反应。多项研究提示TXNIP参与了糖尿病肾病的发生,高糖能够显著上调肾脏细胞TXNIP蛋白和mRNA的表达。新近有研究显示,TXNIP在肝脏脂代谢紊乱导致的脂肪肝方面发挥了调节作用。在1型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中,伴随肝脏脂质沉积,TXNIP的表达明显增高,中药槲皮素和别嘌呤醇通过抑制肝脏TXNIP的表达减轻了肝脏的脂质沉积。TXNIP基因敲除小鼠通过抑制PRMT1-PGC-1?信号途径的激活改善了高脂饮食所致的脂肪肝。但TXNIP在糖尿病导致的肾脏脂质沉积中是否也具有调节作用还未见报道。本研究应用1型和2型两种不同的糖尿病小鼠模型和体外培养的肾小管上皮细胞HK-2,从整体、细胞和分子等不同水平,系统全面地观察了TXNIP在糖尿病肾脏脂质沉积中的作用及调节机制,并观察了天然抗氧化剂花青素对高糖条件下肾小管上皮细胞txnip的表达及脂质沉积的影响,为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制及其防治提供理论依据。方法:1糖尿病肾病患者肾组织txnip、srebp-1和ppar?的表达及脂质沉积收集2010年10月~2014年10月在保定市第一中心医院肾内科住院,经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者20例(diabeticnephropathygroup),既往无其它肾脏病史,以10例肾脏肿瘤患者切除的肾脏远端瘤旁组织做为对照组(controlgroup)。留取血和尿标本检测血糖(glu)、糖化血红蛋白(hba1c)、血胆固醇(tc)、血甘油三酯(tg)、24小时尿蛋白定量(upe)、肌酐(scr)、估算肾小球滤过率(egfr)等。采用油红o染色检测细胞内脂滴形成;免疫组织化学检测txnip、srebp-1及ppar?蛋白表达。2txnip基因敲除对stz诱导的糖尿病小鼠肾组织脂质沉积的影响6~8周龄c57bl/6j背景的野生型小鼠(wildtype)及txnip基因敲除鼠(txnip?/?)为动物模型。将实验动物随机分为4组,野生型c57bl/6j小鼠组(wt)、糖尿病组(wt+stz)、txnip基因敲除组(tko)和txnip基因敲除+糖尿病组(tko+stz)。每组10只,wt+stz和tko+stz组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,stz,溶于0.1mol/l枸橼酸盐缓冲液中,ph值4.5,50mg/kg/day),连续注射5天;对照组注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,5天后血糖仪测定空腹血糖,血糖≥11.1mmol/l且尿糖阳性者(+++~++++)确定为dm模型。实验期间动物自由进食和饮水,每周测一次血糖。dm小鼠成模20周后处死小鼠,收集血尿标本,用于生化指标检测,切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和电镜检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及rna,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表达,real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表达,油红o染色检测小鼠肾组织脂滴形成情况。3敲低txnip对高糖诱导的肾小管细胞hk-2脂质沉积的影响人肾小管上皮细胞hk-2在37°c,5%co2条件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培养基培养。⑴检测高糖对hk-2细胞txnip表达和脂滴形成的影响:细胞分为正常糖对照组(5.5mmol/lglucose,ng)及高糖组(30mmol/lglucose,hg),刺激细胞,孵育0、6、12、24、48、72h后收集细胞,westernblot及real-timepcr检测细胞txnip的表达,油红o染色检测细胞脂滴形成。⑵检测txnip对高糖诱导的hk-2细胞脂质沉积的影响:使用fugene?hd转染试剂将txnipshrnaplasmid(t)干扰质粒和空白质粒(v)分别转染人肾小管上皮hk-2细胞,经嘌呤霉素筛选浓度(4μg/ml)筛选稳定的细胞系。细胞随机分为正常糖对照组(5.5mmol/lglucose,ng)、高渗对照组(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖组(30mmol/lglucose,hg)、高糖+空白质粒组(30mmol/lglucose+vector,hg+v)、高糖+txnipshrna质粒组(30mmol/lglucose+txnipshrna,hg+t)。细胞分组刺激48h后,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表达;real-timepcr检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表达;流式细胞仪检测细胞ros的变化;油红o染色检测细胞脂滴形成;试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。⑶检测pi3k/akt/mtor信号通路在高糖诱导的hk-2细胞脂质沉积中的意义:细胞随机分为正常糖对照组(5.5mmol/lglucose,ng)、正常糖+ly294002组(5.5mmol/lglucose+10μmol/lly294002,ng+ly)、高渗对照组(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖组(30mmol/lglucose,hg)、高糖+ly294002组(30mmol/lglucose+10μmol/lly294002,hg+ly)。检测方法及指标同上。4天然抗氧化剂花青素对高糖诱导的肾小管上皮细胞txnip的表达及脂质沉积的影响①动物实验:16只雄性db/db小鼠随机抽取8只做为糖尿病肾病模型组(db/dbgroup,db/db)、余下8只为葡萄籽原花青素治疗组(grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentgroup,db/db+gspe);16只db/m小鼠随机抽取8只作为正常对照组(db/m),余下8只为葡萄籽原花青素治疗对照组(grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentcontrolgroup,db/m+gspe)。db/db+gspe组和db/m+gspe组给予5mg/kg/day葡萄籽原花青素灌胃,持续8周,对照组和模型组给予相同体积生理盐水。实验期间动物自由进食和饮水,每2周测一次血糖及体重。小鼠15周龄时处死小鼠,收集血尿标本,用于生化指标检测,切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和电镜检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及rna,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表达,real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表达,油红o染色检测小鼠肾组织脂滴形成情况。②细胞实验:人肾小管上皮细胞hk-2在37°c,5%co2条件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培养基培养。⑴检测花青素对hk-2细胞细胞活力及ros产生的影响:细胞用含10、20、50、100μm的c3g或cy刺激物的培养基培养细胞48h,mtt法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞ros的变化。⑵检测花青素对高糖诱导的hk-2细胞txnip表达及脂质沉积的影响:细胞随机分为正常糖对照组(5.5mmol/lglucose,ng)、高渗对照组(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖组(30mmol/lglucose,hg)、高糖+c3g组(30mmol/lglucose+c3g,hg+c3g)、高糖+cy组(30mmol/lglucose+cy,hg+cy)。细胞分组刺激48h后,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表达;real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表达;流式细胞仪检测细胞ros的变化;油红o染色检测细胞脂滴形成。结果:1糖尿病肾病患者临床病理表现及相关蛋白检测①光镜下观察:对照组肾小球毛细血管袢开放良好,肾小管及间质未见明显异常;糖尿病肾病组肾小球体积增大,基底膜不规则增厚,系膜细胞及系膜基质增生,晚期肾小球硬化;肾小管基底膜增厚,部分小管萎缩,部分小管代偿性肥大,间质纤维化。②糖尿病肾病组患者空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、肌酐较对照组均明显增多,而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降(p0.05或p0.01)。③对照肾组织中未见明显脂质沉积,糖尿病肾病组肾小管上皮细胞内出现大量脂滴,呈红染颗粒状。④免疫组化显示,糖尿病肾病组txnip和srebp-1在肾小管上皮细胞胞浆中表达增多,ppar?在肾小球及肾小管上皮细胞胞浆表达减少,与对照组相比有显著性差异(p0.01)。2txnip基因敲除对stz诱导的糖尿病小鼠肾组织脂质沉积的影响①光镜下观察,糖尿病小鼠肾小球体积略增大,系膜细胞增生伴系膜基质增多,基底膜不规则增厚,肾小管上皮细胞出现空泡变性;txnip基因敲除明显改善了糖尿病所致的肾脏形态学变化。②与wt小鼠相比,糖尿病小鼠bun、scr、tg及uae均显著升高;txnip基因敲除各项指标明显下降(p0.05或p0.01)。③电镜及油红o染色显示糖尿病小鼠近曲小管上皮细胞胞浆内呈现明显的脂滴沉积,肾组织内甘油三酯和胆固醇含量明显高于wt小鼠;txnip基因敲除的糖尿病小鼠小管细胞内脂滴数减少,甘油三酯及胆固醇含量降低(p0.01)。④与wt小鼠比较,糖尿病小鼠肾组织内txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor表达明显增高,而ppar?、cpt1及acox1的表达减少;txnip基因敲除下调了txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor的表达,上调了ppar?、cpt1及acox1的表达,均有统计学意义(p0.05或p0.01)。3敲低txnip对高糖诱导的肾小管细胞hk-2脂质沉积的影响①与ng相比,hg组hk-2细胞中txnip表达明显增高,呈时间依赖性;txnipshrna质粒转染明显降低了hg诱导txnip蛋白的表达。油红o染色显示细胞内脂滴数明显增加,与刺激时间成正比。②txnipshrna质粒转染抑制了hg诱导的hk-2细胞脂滴形成及甘油三酯含量的增加(p0.01)。③与ng组相比,hg组srebp-1、fasn和acc表达明显增加,akt和mtor的磷酸化水平升高,ppar?、cpt1及acox1表达减少;txnipshrna质粒转染能够降低hg诱导的srebp-1、fasn和acc表达增加及akt和mtor的磷酸化水平升高,上调ppar?、cpt1及acox1表达(p0.05或p0.01)。甘露醇及空白质粒无影响。④与hg组相比,ly294002抑制了akt和mtor的磷酸化水平升高,降低srebp-1、fasn及acc的表达,增加ppar?、cpt1及acox1的表达;抑制了细胞内甘油三酯含量的增加(p0.05或p0.01)。4天然抗氧化剂花青素对高糖诱导的肾小管上皮细胞txnip的表达及脂质沉积的影响①光镜下观察,db/db小鼠肾小球体积略增大,系膜细胞增生伴系膜基质增多,基底膜不规则增厚,肾小管上皮细胞出现空泡变性;葡萄籽原花青素(GSPE)干预明显改善了糖尿病所致的肾脏形态学变化。与db/m小鼠相比,db/db小鼠FBG、BUN、Scr、TG、TC及UAE均显著升高;葡萄籽原花青素(GSPE)干预各项指标明显下降(P0.05或P0.01)。②电镜及油红O染色显示db/db小鼠近曲小管上皮细胞胞浆内呈现明显的脂滴沉积,肾组织内甘油三酯和胆固醇含量明显高于db/m小鼠;葡萄籽原花青素(GSPE)干预后脂滴数减少,甘油三酯及胆固醇含量降低。③与db/m小鼠比较,db/db小鼠肾组织内TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC表达明显增高,而PPAR?、CPT1及ACOX1的表达减少;葡萄籽原花青素(GSPE)干预后TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC表达减少,PPAR?、CPT1及ACOX1的表达增加,均有统计学意义(P0.05或P0.01)。④花青素干预能够明显抑制HG诱导HK-2细胞TXNIP表达、ROS的生成及脂滴沉积(P0.05或P0.01)。⑤与NG组相比,HG组SREBP-1、FASN和ACC表达明显增加,PPAR?、CPT1及ACOX1表达减少;花青素干预能够降低HG诱导的SREBP-1、FASN和ACC表达增加,上调PPAR?、CPT1及ACOX1表达(P0.05或P0.01)。甘露醇及空白质粒无影响。结论:1在糖尿病患者及小鼠模型肾组织和体外培养的HK-2细胞中均发现高糖显著诱导了TXNIP的表达,同时肾小管上皮细胞出现明显的脂质沉积,提示TXNIP可能参与了肾小管上皮细胞异常的脂质代谢过程。2 TXNIP基因敲除通过抑制脂肪酸合成相关蛋白的表达及增加脂肪酸?氧化相关蛋白的表达减轻了糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的HK-2细胞脂质异常沉积,这一作用可能是通过抑制Akt和mTOR的活化实现的。3花青素干预抑制糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的HK-2细胞TXNIP的高表达,同时通过抑制脂肪酸合成相关蛋白的表达及增加脂肪酸?氧化相关蛋白的表达减轻了小管细胞脂质沉积,提示花青素可能部分通过抑制TXNIP的表达对DN脂代谢紊乱有改善作用。
【图文】：

糖尿病肾病,肾组织,对照组,HE染色

1-1 对照组及糖尿病肾病组肾组织 HE 染色(×400)E staining of renal tissues in control group and DN grouA: control group, B, C, D: DN group.

糖尿病肾病,肾组织,对照组

1-1 对照组及糖尿病肾病组肾组织 HE 染色(×400)E staining of renal tissues in control group and DN groupA: control group, B, C, D: DN group.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】