精索静脉曲张患者不育标记物的蛋白质组学筛选及验证

发布时间：2019-12-06 03:54

【摘要】：研究背景及目的:近年来,男性不育的发病率逐年上升。造成男性不育的因素众多,精索静脉曲张是最常见的原因之一。尽管精索静脉曲张对患者的生育能力有明显影响已成为医学界的共识,但是其造成不育的具体机制仍不明确。有研究发现,精索静脉曲张可能导致睾丸温度调节功能障碍,从而造成慢性缺氧和活性氧物质过度产生,使生精细胞在精子生发阶段呈现出特异性凋亡。蛋白质组学作为一种前沿的研究方法,能够在分子水平对细胞或组织内的蛋白质功能和代谢过程进行精细研究。同位素标记的相对和绝对定量技术(i TRAQ)已在科研领域得到广泛应用,在对不同疾病状态下男性不育蛋白的研究中具有较高的价值。精浆的来源是男性前列腺、精囊腺、尿道球腺、附睾等腺体的分泌物,其主要成分为脂质、碳水化合物、大量多肽和蛋白质等,因此,精浆中高浓度的组织特异性蛋白可以作为男性生育能力评估的生物学指标。本实验基于先前的研究基础,进一步对精浆蛋白进行蛋白质组学分析,旨在筛选出在精索静脉曲张并不育患者和正常人间具有明显差异性的蛋白质。通过对差异蛋白进行分子功能的研究,深入探讨精索静脉曲张导致男性不育的分子机制。同时,对筛选出的差异蛋白进行蛋白印迹(western bolt)验证,获取精索静脉曲张致不育的蛋白标记物,为临床中的诊断和治疗提供支持。实验方法:收集左侧精索静脉曲张不育患者20份精液样本以及20份正常生育男性精液样本,提取精浆作为实验样本。使用同位素标记的相对和绝对定量技术,研究样本使用i TRAQ试剂盒标记,117标记精索静脉曲张不育患者组的精浆、114标记正常生育者组的精浆,进行蛋白质组学的分析。使用Proteome Discoverer1.3软件对得到的质谱进行数据分析,对差异表达蛋白选择上调倍数≥1.5,下调差异倍数≤0.7,P≤0.05认为差异具有统计学意义。对差异蛋白进行基于基因本体的分子功能的富集进行分析,并从获得的差异蛋白中挑选可以作为不育标记物的蛋白。精索静脉曲张不育组和正常生育组中的精浆样本进行蛋白印迹实验,使用image pro plus 7.0软件对得到的图像进行灰度分析,以对获得的差异表达蛋白进行验证。实验结果:鉴定出差异表达蛋白共39个,其中上调蛋白22个,下调蛋白17个。分子功能分析得出差异蛋白的分子功能共有14种,其中主要体现在蛋白结合、催化活性及结构分子活性方面。C2 domain-containing protein 2(C2CD2)和actin-binding LIM protein 3(LIM3)在精索静脉曲张患者中分别上调了2.532倍,2.162倍,而echinoderm microtubule-associated protein-like 1(EML1)下调了0.544倍。Western blot实验验证C2CD2、LIM3较正常组表达明显增高,EML1较正常组表达降低。结论:精索静脉曲张潜在致病蛋白主要通过影响蛋白结合、催化活性及结构分子活性诱发男性不育。C2CD2、LIM3、EML1三个蛋白的异常表达与精索静脉曲张并不育具有显著相关性,可以初步作为精索静脉曲张患者的不育标记物。i TRAQ技术是筛选精索静脉曲张不育相关蛋白的有效工具。
【图文】：

2CD2的westernblot结果

精索静脉曲张患者不育标记物的蛋白质组学筛选及验证

LIM3的westernblot结果
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R697.24

【参考文献】