【摘要】：肾纤维化是各种慢性肾脏病(CKD)向终末期肾脏病(ESRD)进展的共同通路,而炎症是纤维化发生发展的重要机制。在炎症相关的众多细胞和因子中,巨噬细胞在纤维化发生发展中起着极其重要的作用,其活化状态不同作用不尽相同。淋巴管是炎症领域的新热点,除在生理状态下参与维持体液平衡、吸收营养物质,还在肿瘤迁移、移植排斥、损伤修复等多种病理状态发生重要作用。各种组织中,巨噬细胞通过直接和间接机制参与淋巴管新生,调节炎症反应；而巨噬细胞成熟分化被认为与自噬有关,经典促淋巴管生长因子血管内皮生长因子C(VEGF-C)据报道可以调节自噬。近来有报道淋巴管新生与肾纤维化有关。因此我们推测,巨噬细胞与肾纤维化淋巴管新生之间存在密切联系,其机制与自噬有关。在本研究中,我们通过体内外实验探讨肾间质中淋巴管新生与纤维化和巨噬细胞浸润的关系,以及巨噬细胞参与淋巴管新生机制。我们研究发现在不同纤维化模型中均存在巨噬细胞浸润、淋巴管新生和肾脏纤维化,且淋巴管新生与纤维化程度和巨噬细胞浸润呈正相关。同时我们发现巨噬细胞经典活化型(M1)比替代活化型(M2)和静息型(M0)更可能分化为淋巴管内皮细胞(LEC),且VEGF-C可以促进M1分化,转分化为LEC潜能增加：抑制VEGF-C/VEGFR3通路后,可以逆转此效应。而VEGF-C能够抑制巨噬细胞自噬,抑制VEGF-C/VEGFR3通路增加巨噬细胞自噬。自噬诱导剂雷帕霉素也会削弱巨噬细胞向M1分化,降低其分化为LEC潜能。综上所述,肾纤维化中VEGF-C通过下调巨噬细胞自噬,使之向M1分化增加,进一步增强转分化为LEC潜能,促进淋巴管新生。第一部分肾纤维化中淋巴管新生与巨噬细胞浸润的关系目的研究小鼠肾纤维化模型中淋巴管新生情况,及其与间质浸润巨噬细胞和纤维化的关系。方法构建小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)和阿霉素肾病(ADR)纤维化模型,Masson染色观察肾纤维化程度,免疫组化、Western blot和realtime PCR检测纤维化(α-SMA、 Collagenl、PDGFR)、巨噬细胞F4/80、淋巴管生成(LYVE-1、Prox-1、VEGF-C);免疫荧光双标检测F4/80和LYVE-1。对UUO模型使用氯膦酸盐脂质体(clodronate liposome)耗竭巨噬细胞,对照使用空载脂质体(liposome PBS)和PBS,收集标本后检测上述各项指标。结果在假手术组和对照组,Masson染色未见胶原纤维,α-SMA、CollagenⅠ、PDGFR-β、 F4/80、LYVE-1、Prox-1和VEGF-C低表达；在UUO和ADR模型中,Masson染色可见肾间质明显纤维化,α-SMA、CollagenⅠ、PDGFR-β、F4/80、LYVE-1、Prox-1和VEGF-C表达明显增加,且随病程延长而增加。用imagepro plus软件对模型组α-SMA、F4/80、LYVE-1和VEGF-C免疫组化染色定量及相关性分析后发现LYVE-1表达与VEGF-C、α-SMA和F4/80的表达均为正相关。Clodronate liposome干预UUO后,Masson染色示纤维化明显减轻,α-SMA、Collagenl、PDGFR-β、F4/80、LYVE-1、 Prox-1和VEGF-C的表达均大幅下降。而F4/80和LYVE-1在纤维化模型中存在共定位。结论间质淋巴管新生与纤维化程度和巨噬细胞浸润数量均成正相关,在肾脏纤维化中巨噬细胞可能直接转分化入淋巴管内皮细胞形成淋巴管结构。第二部分肾纤维化中巨噬细胞通过VEGF-C/VEGFR3通路转分化为淋巴管内皮细胞目的验证巨噬细胞转分化为淋巴管内皮细胞形成淋巴管结构的能力和机制方法分离培养小鼠骨髓来源单核巨噬细胞,不加刺激为M0,加入IFN-y/LPS诱导为经典活化型巨噬细胞(M1),加入IL-4/IL-13诱导为替代活化型巨噬细胞(M2)；用光学显微镜观察形态,Western blot检测iNOS和Arginase, realtime PCR检测iNOS、 Arginase、TNF-α、CD206、YM-1和FIZZ-1,流式细胞术检测Dectin-1、MHC-Ⅱ和CD86,免疫荧光检测iNOS和CD206,鉴定巨噬细胞表型；鉴定成功后,用VEGF-C分别刺激M0/M1/M2,对M1使用Lipofectamine RNAimax转染VEGF-C的SiRNA或者VEGFR3的抑制剂SAR131675,多种方法检测LYVE-1、Prox-1、Podoplanin, VEGFR3、VEGF-C、iNOS、CD206、Arginase;将M0/M1/M2(有或无VEGF-C刺激)分别培养于生长因子减少型Matrige1中,用EBM-2培养基进行三维培养,每天用倒置光学显微镜观察；将M1/M2用或不用VEGF-C刺激后,以DiI标记,尾静脉回输至UUO和ADR内,收取标本后,用肾组织冰冻切片直接观察红色荧光,并用荧光检测DiI与LYVE-1或F4/80共定位。结果提取分化的三型细胞中,M0形态较圆：M1轮廓不清、有大量鞭毛,高表达iNOS、 TNF-α MHC-Ⅱ和CD86；M2细胞较肥大、更长,高表达Arginase、CD206、Dectin-1、YM-1和FIZZ-1；说明分离及诱导分化培养成功。Western blot、免疫荧光和realtime PCR结果显示M1表达LYVE-1、Pro x-1和Podoplanin明显高于M0/M2, LYVE-1、Podoplanin与iNOS共定位,与CD206不存在共定位；加入VEGF-C后,M1表达iNOS、LYVE-1、 Prox-1和Podoplanin进一步增加,此效应可被VEGF-C-siRNA或者VEGFR3的抑制剂SAR131675消除。与此一致的是,无论在体外三维培养还是回输至纤维化模型中,M1比M0/M2生成更多淋巴管样结构,且DiI-M1与F4/80和LYVE-1存在共定位。结论M1高表达淋巴管标记物,在体外和体内都能转分化为淋巴管内皮细胞,形成管样结构或者成为淋巴管结构一部分;VEGF-C能够促进M1标记物增加,转分化能力更强,而沉默VEGF-C和VEGFR3抑制剂SAR131675能下调M1表型标记物,削弱其转分化为淋巴管的能力。第三部分VEGF-C/VEGFR3通路调控巨噬细胞自噬促进其向淋巴管内皮细胞转分化的机制目的探索VEGF-C介导的自噬在巨噬细胞转分化为淋巴管内皮细胞中的作用和机制方法体外实验中,用VEGF-C分别刺激M0/M1/M2,在M1使用Lipofectamine RNAimax转染VEGF-C-siRNA或者VEGFR3抑制剂SAR131675,免疫荧光和Western blot检测LC3和p62;用雷帕霉素分别刺激M0/M1/M2, Western blot检测LC3、p62、 iNOS、Arginase、LYVE-1、Prox-1和Podoplanin。体内实验中,免疫荧光双标检测UUO和ADR组织中F4/80和LC3；雷帕霉素干预UUO后,流式细胞术检测肾脏F4/80+ CDllb+CD86+MHC-Ⅱ+M1型巨噬细胞比例和F4/80+CD11b+ Podoplanin+细胞的比例。结果在UUO和ADR中,巨噬细胞存在不同程度自噬。免疫荧光和Western blot显示M1低表达LC3Ⅱ/Ⅰ,高表达p62; VEGF-C可分别使M0/M1/M2上LC3Ⅱ/Ⅰ降低,p62升高；Western blot显示VEGF-C的siRNA或者VEGFR3的抑制剂SAR131675可消除此效应。雷帕霉素分别刺激M0/M1/M2后,LC3Ⅱ/Ⅰ均上调,p62、iNOS、Prox-1、 Podoplanin和LYVE-1下调;而雷帕霉素干预UUO模型后,F4/80+CDllb+CD86+ MHC-Ⅱ+M1型巨噬细胞和F4/80+CD11 b+Podoplanin+细胞在F4/80+CD11b+细胞中比例均下降。结论VEGF-C可以通过下调巨噬细胞自噬,促使巨噬细胞向M1分化增加,表达淋巴管内皮细胞标记增加,用自噬诱导剂刺激巨噬细胞后,出现相反的效果。我们研究结果说明VEGF-C/VEGFR3调控巨噬细胞自噬在巨噬细胞向淋巴管转分化中扮演了重要角色,为纤维化中干预炎症反应提供新思路。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
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