雷帕霉素对IgA肾病大鼠的治疗作用及机制研究

发布时间：2020-02-10 07:32

【摘要】：IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是以出现镜下血尿或肉眼血尿或蛋白尿、血清IgA水平升高、肾脏病理显示肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积,导致系膜细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的一类肾小球肾炎。目前认为IgA肾病在世界各地都是原发性肾小球肾炎中最常见的类型,在确诊后5～25年内,约20%-40%的患者不可逆地进展为终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)。本课题重点研究了雷帕霉素在IgA肾病大鼠模型中的治疗效果及作用机制,同时探讨雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制以及对信号转导通路PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK1/2的影响。 第一部分雷帕霉素治疗IgA肾病大鼠疗效观察及机制研究 目的：IgA肾病(IgAN)是世界范围内最常见的肾小球肾炎,因其发病机制不清,所以临床上尝试不同的治疗方法。本研究旨在探讨低剂量mTOR抑制剂雷帕霉素对IgA肾病大鼠模型的潜在的保护能力及可能的作用机制,为临床治疗IgA肾病提供新思路。 方法：首先我们建立IgA肾病大鼠模型,大鼠分为4组：正常对照组(control)正常对照+雷帕霉素组(control+Rapa)、IgA肾病组(IgAN)、IgA肾病组+雷帕霉素组(IgAN+Rapa)每组10只；雷帕霉素(1mg/kg/d)灌胃给药,持续4周,对照组给予等量生理盐水灌胃。每周测各组大鼠体重；分别于4、8、12、16周末,用代谢笼收集各组大鼠24小时尿液,采用丽春红S法检测24小时尿蛋白；16周末处死大鼠,分离血清,取材。采用DxC800型自动生化分析仪检测各项生化指标；冰冻切片免疫荧光观测IgA沉积；HE、PAS、Massion染色后进行肾组织形态学分析;BrdU检测系膜细胞的增殖；免疫组化法及Real-time PCR检测肾皮质TGF-β1、PDGF-B、α-SMA、CollagensⅠ和Ⅲ蛋白及mRNA的表达；最后我们用免疫组化及Western blotting检测了肾皮质pS6蛋白表达。 结果：1)雷帕霉素可以减少蛋白尿,预防血肌酐升高,同时对大鼠体重及肝功能无影响；2)雷帕霉素直接或间接干扰IgAN发展为终末期肾病(ESRD)的多个关键环节：①减少了IgA的沉积、抑制系膜细胞增殖；②减少IgA肾病大鼠系膜细胞a-SMA表达及细胞外基质collagenⅢ的分泌；③下调促纤维化生长因子PDGF-B和TGF-β1的表达。3)IgA肾病大鼠中pS6表达升高,说明mTORC1信号通路被激活,S6磷酸化为pS6；雷帕霉素作为mTORC1的特异抑制剂,可以阻断其激活,抑制S6磷酸化。 结论：在IgA肾病大鼠中mTOR通路被激活,早期小剂量应用mTOR抑制剂雷帕霉素可阻断mTOR通路；同时雷帕霉素减少蛋白尿及IgA的沉积,抑制肾小球系膜细胞(MC)增殖、细胞因子和细胞外基质(ECM)分泌及三者之间的相互作用,从而减缓IgA肾病大鼠的肾损伤。 第二部分雷帕霉素抑制大鼠系膜细胞增殖的机制研究 目的：IgA肾病以系膜细胞增殖为主要病理特点,所以我们培养大鼠系膜细胞,研究雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制,以及其对信号转导通路PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK1/2的影响。 方法：常规培养HBZY-1细胞,分为control组、PDGF组、RAPA1nmol/L组、RAPA10nmol/L组、RAPA100nmol/L组、RAPA1000nmol/L组,MTT法检测24h、48h细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡；蛋白提取及Western blotting分析肾皮质细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、CDK2及CDK4表达;Western blotting及RT-PCR检测p27蛋白及mRNA表达量;Western blotting分析信号传导通路蛋白p-P70S6K/P70S6K、p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERKl/2的表达量。 结果：1)雷帕霉素呈剂量依赖性的抑制PDGF引起的系膜细胞增殖,阻断细胞周期在G1期,但100nmol/L与1000nmol/L组并未见明显差异；雷帕霉素不影响系膜细胞的凋亡；2)雷帕霉素不影响PDGF组上调的Cyclin D1、E及CDK2、4表达量；但可以通过调控mRNA的转录,增加p27蛋白表达；3)雷帕霉素剂量依赖性的抑制PDGF引起的P70S6K磷酸化,1000nmol/L抑制作用最强；10nmol/L及100nmol/L雷帕霉素对PDGF刺激升高的p-AKT及p-ERK1/2均未见显著影响,1000nmol/L干预时,p-AKT、p-ERK1/2较10及100nmol/L组的蛋白表达量略有升高。 结论：雷帕霉素通过mTORCl/P70S6K通路调控p27mRNA转录,增加其蛋白表达,从而抑制cyclin E-CDK2的活性,阻断细胞周期由G0-G1期进入S期,抑制细胞的增殖；在大鼠系膜细胞中,大剂量使用雷帕霉素(1000nmol/L)可能会反馈激活AKT及Ras/Raf/ERK,从而减弱雷帕霉素抑制细胞增殖的效果。
【图文】：

山西医科大学博士学位论文 结果、IgA肾病大鼠动物模型的建立.1 IgA免疫荧光沉积正常对照组在第6周及12周末大鼠肾组织均未见明显的IgA沉积，焚光强一?±; IgA肾病大鼠第6周末系膜区开始出现颗粒状的IgA沉积,劳光强度为-++, 12周末IgA沉积显著，呈连续性片状沉积，焚光强度达到+++?++++。6 week 12 week

图1.1-3各组大鼠体重增长情况（3^±s，g)帕霉素明显减少24h尿蛋白量模前各组大鼠蛋白尿定性阴性，在造模第4周末开始出现少量的尿蛋白，照组比较，差异有统计学意义（P<0.05);此后，模型组尿蛋白持续升高，末达到19.38±4.25mg/24h;与对照组比较有显著差异（尸<0.01); 16周末，，组蛋白尿仍继续增长至32.61±6.46mg/24h，而RAPA干预治疗4周后，模的尿蛋白由22.00±3.98 mg/24h降低至15.52±2.76 mg/24h,但仍高于对照组2±0.33 mg/24h，差异均有统计学意义（尸<0.01)。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.31

【共引文献】

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本文编号：2578105