【摘要】：目的:研究阿魏酸拮抗人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)向肌成纤维细胞转分化的作用。方法:以HK-2细胞为研究对象,采用不同浓度(1、5、10 ng/mL)转化生长因子-b1(TGF-b1)刺激细胞不同时间(12、24、48、72 h),通过观察细胞形态及a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)荧光强度筛选出建立HK-2细胞转分化为肌成纤维细胞(模型细胞)的最适条件,即TGF-b1的浓度及时间。再予不同浓度(125mmol/L、250mmol/L、500mmol/L)阿魏酸干预模型细胞,显微镜下观察阿魏酸对模型细胞形态的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液纤维连接蛋白(Fn)、I型胶原蛋白(Col I)表达水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞α-SMA、整合素连接激酶(ILK)蛋白质表达水平;实时荧光定量(qPCR)方法检测α-SMA、Fn、Col I、ILK mRNA表达水平。结果:(1)10 ng/mL TGF-β1干预HK-2细胞24 h,细胞形态由椭圆形或多边形变为长梭形,形态改变最为明显,免疫荧光检测的α-SMA蛋白阳性信号表达最强。(2)阿魏酸对模型细胞形态的影响:对照组细胞为椭圆形或多边形;模型组细胞为长梭形;低、中、高剂量阿魏酸组,细胞形态趋向对照组。(3)阿魏酸对模型细胞α-SMA、Fn、Col I、ILK、α-SMA蛋白表达水平的影响:免疫荧光检测各组细胞α-SMA蛋白阳性信号,模型组阳性信号最强,低、中、高剂量阿魏酸组细胞的α-SMA蛋白阳性信号随阿魏酸浓度的增加而减弱。ELISA检测细胞上清液Fn、Col I蛋白表达水平:对照组、模型组、阿魏酸低剂量组、阿魏酸中剂量组及阿魏酸高剂量组Fn蛋白质表达水平分别为(138.57±14.99)pg/mL、(554.82±7.83)pg/mL、(491.16±9.69)pg/mL、(270.23±18.47)pg/mL、(195.99±5.91)pg/mL(P0.01),Col I蛋白质表达水平分别为(1418.60±154.08)pg/mL、(6652.40±458.53)pg/mL、(5430.77±227.28)pg/mL、(4424.77±329.92)pg/mL、(2279.07±369.12)pg/mL(P0.01)。Western blot检测细胞α-SMA、ILK蛋白表达水平:对照组、模型组、阿魏酸低剂量组、阿魏酸中剂量组及阿魏酸高剂量组α-SMA蛋白质表达水平分别为0.14±0.01、0.40±0.01、0.36±0.01、0.23±0.01、0.16±0.01(P0.01),ILK蛋白质表达水平分别为0.14±0.02、0.46±0.02、0.38±0.01、0.33±0.01、0.29±0.01(P0.01)。(4)阿魏酸对模型细胞α-SMA、Fn、Col I、ILK mRNA表达水平的影响:对照组、模型组、阿魏酸低剂量组、阿魏酸中剂量组及阿魏酸高剂量组α-SMA mRNA表达量分别为1.00±0.00、1.72±0.14、1.38±0.10、1.20±0.08、1.00±0.08(P0.01),Fn mRNA表达量分别为1.00±0.00、2.96±0.21、1.95±0.15、1.69±0.13、1.26±0.05(P0.01),Col I mRNA表达量分别为1.00±0.00、2.96±0.12、2.62±0.05、1.79±0.07、1.17±0.04(P0.01),ILK mRNA表达量分别为1.00±0.00、2.31±0.16、1.78±0.11、1.55±0.11、1.29±0.09(P0.01)。(5)ILK蛋白质表达水平与Fn、Col I、α-SMA蛋白质相关性分析:ILK与Fn、Col I、α-SMA均呈正相关,相关系数分别为0.897(P0.05)、0.938(P0.05)、0.890(P0.05)。结论:(1)10 ng/mL TGF-b1刺激HK-2细胞24 h是TGF-b1诱导HK-2细胞转分化为肌成纤维细胞的较好条件。(2)阿魏酸下调模型组细胞ILK、Fn、Col I、α-SMA的mRNA及蛋白质表达水平,阻抑TGF-b1诱导的HK-2细胞向肌成纤维细胞转分化。(3)阿魏酸拮抗HK-2细胞向肌成纤维细胞转分化的作用可能与抑制TGF-β1的下游信号因子ILK有关。
【图文】：
第 3 章 结果K-2 细胞转分化为肌成纤维细胞模型细胞转分化模型最适 TGF-β1 浓度筛选不同浓度的 TGF-β1 刺激下细胞形态变化K-2 细胞生长 24 h 后，形成融合的单层上皮细胞，显微镜下呈有上皮细胞典型的铺路石样的形态（图 1A）。分别予 1ng/mLTGF-β1 干预 HK-2 细胞 24 h，细胞形态均出现不同程度的改形态由椭圆形或多边形逐渐拉长为梭形，细胞间排列逐渐疏图 3.1B、3.1C、3.1D），10 ng/mL 组细胞形态改变最为明显（g/mL 的 TGF- 1 对 HK-2 细胞形态影响最为明显。
不同浓度 TGF-β1 对 HK-2 细胞 -SMA 表达的影响（ 400，标尺：光为 -SMA 阳性表达。A：对照组； B：1 ng/mL TGF- 1 组；C：5 ngg/mL TGF- 1 组。对照组细胞呈现较弱的 -SMA 蛋白阳性信号表达（/mL（C）、10 ng/mL（D）组细胞 -SMA 蛋白阳性信号表达逐渐增强，MA 蛋白阳性信号表达最强（D）。细胞转分化模型最适 TGF-β1 作用时间筛选不同时间 TGF-β1 作用对细胞形态的影响 ng/mL TGF-β1 处理 HK-2 细胞，12 h 后显微镜下观察细胞大边形的正常上皮细胞形态，，少部分细胞呈现长梭形（图 3.3A，大部分细胞变为长梭形，并且细胞间排列疏松（图 3.3B、3.g/mL TGF-β1 刺激细胞 24 h 即具有较强的促进细胞转分化作
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【参考文献】
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2604420
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