S1P1基因转染改善自发性高血压大鼠勃起功能及机制

发布时间：2020-03-30 17:17

【摘要】：目的:高血压与勃起障碍(ED)关系密切,主要影响的信号通路有eNOS/NO信号通路和RhoA/Rho激酶信号通路。本课题前期已证明在高血压状态下存在eNOS/NO信号通路下调及RhoA/Rho激酶信号通路上调。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate S1P)参与eNOS、RhoA/Rho激酶的上游调控。S1P是一类具有生物活性的鞘脂介质,可以与其对应的S1P受体相结合,通过对血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞类型的生物调控作用,参与调节血管张力,引起血管的收缩和扩张。目前已知的S1P受体亚型有5个,其中1-磷酸鞘氨醇受体-1(sphingosine-1-phosphate 1 S1P1)在eNOS介导的血管舒张中有重要作用,其机制可能是通过P13k/Akt信号通路磷酸化eNOS第1177位点的ser后活化体内的eNOS,从而促进NO的生物合成及释放,改善勃起功能。而上调高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体中S1P1的表达能否改善其勃起功能目前尚不清楚。本研究探讨上调SHR大鼠阴茎海绵体中S1P1的表达与勃起功能的关系,阐述高表达的S1P1与eNOS/NO、RhoA/Rho激酶信号通路之间的关系。方法:成年健康雄性正常高血压(WKY)大鼠10只随机分为WKY组和WKY转染组;成年健康雄性SHR大鼠10只随机分为SHR组和SHR转染组。各组大鼠均为12周龄大小,体重约为260-300g。以1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉WKY转染组和SHR转染组,将携带S1P1基因的慢病毒注射到大鼠阴茎海绵体两侧内,慢病毒滴度1x10~9TU/ml,每只大鼠各注射10μl,仔细观察大鼠反应情况,待大鼠清醒后放回笼中,继续饲养一周。慢病毒转染后一周进行ICPmax/MAP值测定、采血及取阴茎海绵体组织:麻醉前称重各组大鼠计算麻醉剂量(以1%戊巴比妥钠30mg/Kg计算),将计算好的麻醉剂注射到大鼠腹腔进行麻醉,将麻醉好的大鼠固定于手术操作台,手术分离及暴露大鼠右侧颈总动脉,在26G针头内注满肝素生理盐水进行右侧颈总动脉穿刺,针头另一侧连接好压力换能器,连续监测大鼠颈总动脉平均动脉压(MAP)的变化。接着在24G针头内注满肝素生理盐水插入大鼠阴茎海绵体内,针头另一侧连接压力换能器,分别用刺激强度0V、3V、5V,波幅5ms,刺激频率12Hz,给予海绵体盆神经节不同强度的电刺激,持续刺激时间45s/次,刺激时间间隔5min,并记录各组大鼠ICPmax/MAP值。待ICPmax/MAP值测定完毕后手术取下大鼠阴茎海绵体并用生理盐水仔细清洗,在颈总动脉处采血2ml用于检测各组大鼠血清睾酮(T)水平。取下的各组大鼠海绵体组织分为四个部分,分别用于荧光染色、Western-blot实验分析、免疫组化分析、生化检测海绵体中一氧化氮(NO)的含量。其中Western-blot印迹方法和免疫组化分别检测大鼠阴茎海绵体中eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1五个指标的蛋白表达。结果:ICPmax/MAP:在0V、3V、5V下SHR组(0.046±0.009、0.223±0.027、0.298±0.020)较WKY组(0.155±0.015、0.712±0.029、0.765±0.020)显著降低(P0.01),SHR转染组(0.093±0.006、0.656±0.046、0.744±0.045)较SHR组显著升高(P0.01),WKY转染组(0.187±0.041、0.768±0.046、0.814±0.042)较WKY组无明显变化。血清睾酮水平WKY组(417.24±22.21ng/dl),SHR组(409.95±11.8ng/dl),WKY转染组(428.82±19.85ng/dl),SHR转染组(415.47±11.5ng/dl)各组无明显差异。荧光染色显示各组携带S1P1基因的慢病毒分布,转染部位为阴茎海绵体内皮细胞,根据图片分析IOD值半定量,WKY转染组转染率为(86.15±4.02)%,SHR转染组转染率为(89.39±3.14)%。Western blot印迹分析各组大鼠海绵体中eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1蛋白条带,将各个指标目的蛋白与内参(GAPDH)比值进行数据分析:SHR组和SHR转染组S1P1、P-eNOS蛋白表达较WKY组和WKY转染组降低(P0.05),SHR转染组较SHR组显著升高(P0.01),WKY转染组较WKY组显著升高(P0.01);SHR组和SHR转染组ROCK1、ROCK2蛋白表达较WKY组和WKY转染组显著升高(P0.05),SHR转染组较SHR组显著降低(P0.01),WKY转染组较WKY组显著降低(P0.01),各组eNOS无明显变化。免疫组化定位各组大鼠阴茎海绵体内eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1:血管内皮细胞和海绵窦血管腔内主要表达eNOS,血管内皮细胞和海绵窦腔内主要表达P-eNOS,海绵体血管平滑肌细胞胞浆主要表达ROCK1、ROCK2,血管内皮细胞主要表达S1P1。采用积分光密度值(IOD)表示进行数据分析,SHR组和SHR转染组S1P1、P-eNOS的表达较WKY组和WKY转染组降低(P0.05),SHR转染组较SHR组显著升高(P0.01),WKY转染组较WKY组显著升高(P0.01);SHR组和SHR转染组ROCK1、ROCK2蛋白表达较WKY组和WKY转染组显著升高(P0.05),SHR转染组较SHR组显著降低(P0.01),WKY转染组较WKY组显著降低(P0.01),各组eNOS无明显变化。海绵体中NO含量WKY组(3.95±0.1umol/gprot),SHR组(2.42±0.29umol/gprot),WKY转染组(5.22±0.18umol/gprot),SHR转染组(3.26±0.44umol/gprotl)。SHR转染组较SHR组NO含量明显升高(P0.01),WKY转染组较WKY组NO含量明显升高(P0.01)。结论:上调自发性高血压大鼠阴茎海绵体中S1P1的表达,可能通过促进eNOS/NO信号通路并抑制RhoA/Rho激酶信号通路改善勃起功能。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R544.1;R698

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