环境因子对肾小管细胞生物活性的影响及鉴定

发布时间：2020-04-19 00:54

【摘要】：近年来,肾脏疾病及其并发症的种类逐渐增多,成为威胁人类健康不容忽视的一类疾病。肾脏疾病的发生发展受多种因素影响,其中环境因子就是一类重要的影响因素。研究建立体外肾小管细胞在环境因子作用下发生的形态学及生理生化等变化的检测评价手段,对于研究肾脏疾病尤为重要。本论文以大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E为模式研究对象,分别用不同浓度的葡萄糖和结缔组织生长因子(CTGF)与NRK-52E细胞进行共培养,检测它们对NRK-52E细胞生物活性的影响。利用原子力显微镜(AFM)力学检测技术,在单细胞水平检测细胞形貌、高度、杨氏模量和粘附力的改变,并与生物学分析方法进行结合验证。AFM检测结果表明:葡萄糖(终浓度为5.5、10、25 mM)和CTGF(终浓度为0、2、10 ng/mL)刺激72 h后,细胞的形貌均由椭圆形逐渐变成长梭形,细胞高度增加、粘附力降低、杨氏模量增高,且都呈现剂量依赖性关系,当葡萄糖浓度达50 mM、CTGF浓度达50 ng/mL时细胞损伤严重,不再呈趋势变化;免疫印迹试验(Western Blot)检测显示E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加,荧光标记显示细胞骨架发生重排,MTT检测细胞活力降低,且均与葡萄糖和CTGF浓度呈剂量依赖性关系。以上研究结果表明,葡萄糖或CTGF刺激均能使NRK-52E细胞发生损伤,降低细胞生物活性。本文利用AFM力学检测技术和生物学检测技术相结合的方法,鉴定不同环境因子对肾小管细胞生物活性的影响,侧重于细胞骨架重排和钙黏蛋白介导的细胞粘附研究,这些发现有助于为研究肾脏疾病提供新的研究思路。
【图文】：

扫描管,趋近,轻敲模式,图片

图 1.1 （a）AFM 的原理示意图，（b）力-扫描管位置变化曲线示意图，实线代表趋近力曲线，虚线代表趋离力曲线，图片来源于文献[51]AFM 的工作模式主要有 3 种，分别为接触模式（Contact mode）、非接触模式（Non-contact mode）以及轻敲模式（Tapping mode），通常以探针针尖作用于待测样品表面的作用力方式来进行划分。本文实验采用轻敲模式对细胞进行扫描成像，轻敲模式是介于接触和非接触模式之间的一种扫描模式。采用轻敲模式对样品进行检测时样品与针尖的接触是非常短暂的，它们之间因接触而产生的作用力微小，对样品的损伤也会较小[52]。与接触模式相比较，轻敲模式不仅能拥有高的成像分辨率，而且能够大大减小针尖对于待测样品表面形貌的改变[53]；与非接触模式相比，轻敲模式对起伏较大的样品表面感知更敏感，进行扫描成像分辨率更高，因此测量较柔软或黏性较大的样品时可以优先选择轻敲模式[54]。在扫描过程中，保持 X-Y 平面不动，悬臂梁在待测样品表面以共振频率的方式振荡，驱动探针针尖以速率的周期性短暂接触样品表面，并通过出来的光强差显示在检测器上来确定针尖在样品上的振动幅度。针尖在未接触样品表面之前做自由振荡，振荡幅度较大，一旦针尖距离样品表面达到作用力阈值，探针便只在 Z 方向上趋近、触

形貌,工作图,探针,细胞

德国 JPK 的 AFM，选用 MLCT 探针测量细胞的形貌和力学定 0.5-1 h，再开始进行细胞测量。稳定仪器时在超净台中进行的死细胞和杂质等洗掉，以防探针被污染导致测量数据不准要先使用连接在光学显微镜侧端的 CCD 相机获得细胞显微胞图像一般由放大 100 倍的镜头获取图像，如图 2.1，使用 C设置由 JPK 的 CellHesion200 软件驱动。将待测的细胞样品压电陶瓷，选择液相模式，调试好激光位置后，通过力校准将探针移动到细胞核附近开始实验，采用轻敲模式进行细胞的 256×256 像素点，图像扫描最大范围为 100×100 μm2，根扫描范围。检测细胞时应用 Hertz-Sneddon 模型，如图 2.1 所探针，探针的弹性系数为 0.05 N/m，，实验室温度为 25℃，湿度为 3.10 V，测量细胞形貌时，模型扫描频率为 0.3 Hz，测近和趋离速率为 1 μm/s，施加的力均为 0.6 nN，扫描速度均镜和 AFM 装置都设置在抗震台上，所有的细胞信息均在相
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

【参考文献】