油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究

发布时间：2020-05-13 14:39

【摘要】：研究背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重、最常见的微血管并发症之一。肾脏纤维化是DN的主要病理结局,也是晚期肾病(ESRD)的主要病因。DN的病理变化主要包括正常肾单位的丢失、大量成纤维细胞和肌成纤维细胞增生、细胞外基质(ECM)如胶原蛋白和纤连蛋白(FN)过量生成并堆积以及肾小球内Kimmelsstiel-Wilson(KW)结节形成,并且伴随着肾小球与肾小管基底膜增厚、肾小管间质纤维化,最终导致肾小球硬化。目前防治DN的措施主要包括控制血糖、血压和血脂等,但目前临床和基础研究阶段的药物只能延缓而不能阻止DN的进展,且大都具有较严重的副作用。因此,寻找有效防治DN的方法与药物具有重要的理论与实践意义。植物来源的生物活性肽由于其潜在的营养和药用价值被广泛应用于各个领域,目前发现的这类多肽有降胆固醇肽、血管紧张素I抑制肽、抗菌肽、免疫调节肽和抗氧化肽等,但这类多肽目前还未应用于抗肾脏纤维化研究。鉴于氧化应激在DN中的重要作用,我们选择了具有抗氧化作用的多肽RAP(序列为YWDHNNPQIR),研究其在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病模型和高糖诱导的肾小球系膜细胞(GMC)中的抗纤维化作用。方法:(1)体内实验:8周龄雄性C57BL/6小鼠连续5天腹腔注射STZ45mg/kg/day,正常组注射相同体积的柠檬酸缓冲液,平衡72h后检测血糖,血糖值大于11.1m M认定为糖尿病模型成功,然后将小鼠随机分成正常对照组(normal control group,Control,n=6)、糖尿病模型组(diabetic model group,DM,n=8)、RAP低剂量组(RAP low dose group,0.1 mg/kg,RAP-L,n=8)和RAP高剂量组(RAP high dose group,0.1 mg/kg,RAP-H,n=8),进行隔天皮下注射给药,其中正常组给予相同体积的PBS溶液,并同时给予糖尿病模型组和给药组高脂高糖饲料(HFD)喂养12周。实验结束前用代谢笼收集尿液检测尿蛋白,取血后检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)和血清TGF-?1水平。解剖收集肾脏后通过六胺银基底膜(PASM)、HE、Masson和天狼星红(Sirius Red)染色进行病理学检测,同时用Western Blot、RT-PCR和免疫组化实验检测小鼠肾脏中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的mRNA水平和蛋白水平表达,还检测了小鼠肾脏中ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。(2)体外实验:高糖诱导GMC细胞后用MTT实验检测RAP对细胞增殖的影响和毒性作用,确定RAP的最佳浓度为50?M和100?Μ。同时,在mRNA水平和蛋白水平,检测高糖诱导GMC细胞中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的表达情况,及ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。此外,用ELISA实验检测细胞培养液中胞外基质FN和COL4的含量。结果:(1)与糖尿病组相比,RAP能够改善DN肾脏纤维化症状,包括改善BUN、Scr和TG等肾脏指标,改善氧化应激指标SOD和MDA,抑制肾脏中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的表达量,减轻肾脏中胶原纤维沉积,改善肾小球肥大及基底膜增厚现象,同时能够抑制肾脏MAPK和NF-?B信号通路。(2)RAP能够显著抑制高糖诱导下GMC细胞培养液中FN和COL4的表达,同时能够下调TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA在mRNA和蛋白水平的表达。此外,RAP抑制GMC细胞中MAPK和NF-?B信号通路。结论:多肽RAP能够通过抑制MAPK和NF-?B信号通路来改善STZ诱导的DN肾脏纤维化和高糖诱导的GMC细胞纤维化作用。
【图文】：

机制,结缔组织生长因子,糖尿病模型,整合素

是 ECM 沉积导致肾脏纤维化的主要刺激因子。1.1.2.2 结缔组织生长因子结缔组织生长因子（CTGF/CCN2）是一种多域的母细胞蛋白，它在不同的组织中起到调节原纤维的作用。高葡萄糖、氧化应激和 AngII 等外界刺激能够使体内 TGF- 1 表达量增加，，从而诱导 CTGF 活化，进一步诱导其下游的纤维化作用。虽然 CTGF 的具体靶细胞目前尚不清楚，但研究发现 CTGF 能够激活 Smad、ERK和 Wnt 等信号通路13,14。在肾脏中，CTGF 能够通过裂解成很小的碎片来激活基质细胞和肾小管上皮细胞。Guha 等人在 1 型和 2 型糖尿病小鼠模型中研究了CTGF 的作用，结果发现在糖尿病模型肾脏中，CTGF 表达量显著增加，并且在单侧输尿管阻塞模型（UUO）中，CTGF 反义寡核苷酸能够抑制肾脏纤维化程度15。Yokoi 等人发现，在转基因的糖尿病模型中，CTGF 的表达量也显著增加，与此同时，小鼠 24h 尿蛋白含量增加、肾小球基底膜增厚、ECM 大量沉积16。Mason等人的研究发现，CTGF 还能够与细胞表面的整合素结合，激活 p42/p44 丝裂原活化蛋白激酶，从而导致系膜细胞中 FN 和 COL4 等 ECM 蛋白大量积聚，而用整合素抗体处理后，又能够显著抑制 ECM 蛋白的合成17。

相互作用图,相关信号,受体

图 1-2 DN 相关信号通路之间相互作用图301.1.3.1 TGF- /Smad 信号通路Smad 蛋白是 TGF- 1 受体的胞内激酶底物，也是目前被唯一证实的介导TGF- 1 在细胞内信号传导的物质，主要有 TGF- 1 受体 I（TbR I）和 TGF- 1 受体 II（TbR II）2 种受体。TGF- 1 受体 II（TbR II）与 TGF- 1 结合后刺激 TGF- 1 受体 I（TbR I）激酶，导致 Smad2 和 Smad3 磷酸化，磷酸化的 Smad2 和 Smad3能够与正常的 Smad4 聚合，从而激活细胞内信号通路31。Smad2、Smad3 和 Smad4的聚合物转移到细胞核中调控目标基因 Smad7的转录，Smad7是Smad2 和Smad3的抑制物，它通过靶向与 TbR I 结合来抑制 Smad2/Smad3 的活化32。在哺乳动物体内，Smad2 和 Smad3 是纤维化因子 TGF- 1 的特异性受体，而 Smad1、Smad5和 Smad8 是骨形态蛋白（BMP）的特异性受体。除了依赖于 Smad 的途径之外，TGF- 1 还通过与非 Smad 途径作用来发挥其生物作用，如有丝分裂蛋白激活蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇 3 激酶和 Rho 激酶途径等33。研究发现，TGF- /Smad信号通路在 1 型和 2 型 DN 病人中被高度激活，即肾小球和肾小管细胞中 Smad2
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】