Slit2和Gremlin1负反馈对高糖诱导肾小管上皮细胞间质转分化作用及机制

发布时间：2020-06-12 23:45

【摘要】：背景和目的:肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的一个重要原因。既往研究表明,肾小管上皮细胞在高糖、炎症状态、代谢紊乱及高尿蛋白等因素的刺激下,可出现氧化应激反应,分泌细胞因子,导致间质炎症和纤维化的发生,参与了DN的发生与发展。但DN具体发病机制尚未完全明确,因此,进一步探讨其相关机制很有必要。新近研究表明,Slit2/ROBO信号通路和Gremlin/BMP2信号通路存在直接负调控关系;已知糖尿病肾病BMP7不足和活性减低是糖尿病肾病进展的重要因素之一,我们推测Slit2\Gremlin\BMP7之间可能存在着某种关系,最终导致Gremlin细胞纤维化作用增强,而Slit2和BMP7抗纤维化作用减弱,但这些均需要我们去证实。本课题拟通过研究高糖环境下,人肾小管上皮细胞(Human renal proximal tubular cell,HK2)中Slit2/ROBO1、Gremlin/BMP7信号通路及其相互作用在肾小管上皮细胞间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及其机制,探讨肾小管中两条抗炎细胞信号通路的减弱或活化,为DN TIF提供治疗新策略。方法:本实验分三部分阐述:第一部分:Slit2对高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的作用及其机制进行HK2细胞的培养,设置高糖刺激浓度10、20mmol/L以及高糖刺激时间24 h、36h、48h,Western blot法检测Slit2、ROBO1、α-SMA和Fibronectin蛋白表达变化,筛选最佳高糖刺激浓度及时间,建立Slit2质粒转染HK2细胞株,分为正常组、对照组、高糖组及高糖+空载组、高糖+Slit2组,48 h后,收集各组总蛋白,采用Western blot法检测α-SMA和Fibronectin表达变化。第二部分:Gremlin1对高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的作用及其机制进行HK2细胞的培养,设置高糖刺激浓度10、20mmol/L以及高糖刺激时间24 h、36h、48h,Western blot法检测Gremlin1和BMP7蛋白表达变化,筛选最佳高糖刺激浓度及时间,建立Gremlin1 shRNA慢病毒稳转细胞株,分为正常组、对照组、高糖组及高糖+空载组、高糖+Gremlin1 shRNA组,收集各组总蛋白,采用Western blot法检测α-SMA和Fibronectin表达变化。第三部分:Slit2和Gremlin1相互负反馈对高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的作用及其机制将HK2细胞分为正常组、对照组、高糖组及高糖+空载组、高糖+Slit2组,经最佳高糖刺激时间及浓度后,收集各组细胞总蛋白,采用Western blot法检测Gremlin1和BMP7、p-smad1/5/9表达变化;将HK2细胞分为正常组、对照组、高糖组及高糖+空载组、高糖+Gremlin1 shRNA组,收集各组细胞总蛋白,采用Western blot法检测Slit2、ROBO1表达变化。结果:第一部分:1、在高糖浓度梯度实验中,与正常组相比,Slit2、ROBO1表达下降和Fibronectin、α-SMA表达增加在高糖浓度20mmol/l最明显;2、在高糖时间梯度实验中,与正常组相比,Slit2、ROBO1表达下降和Fibronectin、α-SMA表达增加在高糖刺激48h最明显;3、在高糖环境下,Slit2过表达及阴性对照质粒转染成功后,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+Slit2组的Fibronectin表达增加,α-SMA表达水平增加;与高糖+空载组相比,高糖+Slit2组的Fibronectin和α-SMA表达下降。第二部分:1、在高糖浓度梯度实验中,与正常组相比,Gremlin1表达升高、BMP7表达下降在高糖浓度20mmol/l最明显;2、在高糖时间梯度实验中,与正常组相比,BMP7表达下降、Gremlin1表达增加在高糖刺激48h最明显;3、在高糖环境下,Gremlin1 shRNA及阴性对照慢病毒感染成功后,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+Gremlin1 shRNA组的Fibronectin表达增加,α-SMA表达水平增加;与高糖+空载组相比,高糖+Gremlin1 shRNA组的Fibronectin和α-SMA表达下降。第三部分:1、在高糖环境下,Slit2过表达及阴性对照质粒转染成功后,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+Slit2组的Gremlin1表达增加,BMP7、p-smad1/5/9表达水平下降;与高糖+空载组相比,高糖+Slit2组的Gremlin1表达水平下降,p-smad1/5/9表达水平升高。2、在高糖环境下,Gremlin1 shRNA及阴性对照慢病毒感染成功后,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+Gremlin1 shRNA组的Slit2和ROBO1表达下降增加;与高糖+空载组相比,高糖+Gremlin1 shRNA组的Slit2、ROBO1表达增加。结论:1、高糖诱导肾小管上皮间质转分化;高糖处理后,Slit2和ROBO1的表达下降;过表达Slit2可以部分抑制高糖诱导的肾小管上皮间质转分化。2、高糖促进Gremlin1表达,降低BMP7表达;敲降Gremlin1可以显著抑制高糖诱导的肾小管上皮间质转分化。3、Slit2和Gremlin1在高糖诱导的肾小管上皮间质转分化中存在相互调控。
【图文】：

陆军军医大学硕士学位论文验条件培养基，将细胞密度稀释为 3×104/ml，按每 3 个复孔；置于 37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵胞换液处理；养基，使用 DME/F12 培养基清洗 3 次，避免产8 溶液 10μl，再次孵育 1 h，用酶标仪测量 450 染细胞实验：Slit2 过表达质粒(上海吉凯，货号 GOCP3659353，元件顺序 Ubi-MCS-3FLAG-CMV-EGFP)及图 2-1、图 2-2）。

1.1.5.2 质粒转染细胞实验（1）质粒来源：Slit2 过表达质粒(上海吉凯，货号 GOCP3651060028QA，载体称 GV365，，基因 ID9353，元件顺序 Ubi-MCS-3FLAG-CMV-EGFP)及其阴性对照(上海凯)，-20℃保存（见图 2-1、图 2-2）。图 2-1 Slit2 过表达质粒片段结构图
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】

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1 彭芳;伍玉婷;刘金颖;秦永洁;;肾小管上皮细胞转分化与糖尿病肾病[J];北方药学;2014年02期

2 杨浩;姜涛;宋秀霞;;CRP、IL-6和TNF-α与糖尿病肾病关系的研究[J];北京医学;2011年04期

3 牛敏,常明,刘淑馨;高糖对体外培养肾小管上皮细胞增殖的影响[J];辽宁实用糖尿病杂志;2003年02期

本文编号：2710283