大鼠肾脏缺血再灌注时间对骨髓间充质干细胞增殖及分化的影响

发布时间：2020-06-14 18:50

【摘要】：目的:本实验拟通过大鼠不同缺血再灌注时间点的损伤性肾匀浆上清液在体外模拟急性肾损伤的微环境,诱导骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及分化,探讨肾脏缺血再灌注后最适合BMSCs增殖、分化的时间。方法:采用贴壁培养法体外分离、培养大鼠BMSCs,分为阴性对照组(干细胞培养基);正常肾脏匀浆组(干细胞培养基+10%大鼠正常肾脏匀浆上清液);缺血再灌注12h组(干细胞培养基+10%大鼠缺血再灌注12h肾脏匀浆上清液);缺血再灌注24h组(干细胞培养基+10%大鼠缺血再灌注24h肾脏匀浆上清液);缺血再灌注48h组(干细胞培养基+10%大鼠缺血再灌注48h肾脏匀浆上清液);缺血再灌注72h组(干细胞培养基+10%大鼠缺血再灌注72h肾脏匀浆上清液);缺血再灌注96h组(干细胞培养基+10%大鼠缺血再灌注96h肾脏匀浆上清液)。用CCK8法及细胞板计数法观察肾脏匀浆对BMSCs增殖的影响;在第1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d、23d、25d、27d在倒置显微镜下观察细胞形态学改变;采用Western Blot以及逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)评估细胞内角蛋白18(CK-18)的表达,观察各组对BMSCs的分化的影响。结果:1.BMSCs培养至第3代时可见贴壁生长的呈排列密集、旋涡状、形态相对均一的长梭形样细胞群;流式细胞术鉴定细胞表型CD29,CD90表达阳性,CD34,CD45表达阴性;BMSCs经成脂诱导后,能分化为脂肪细胞。2.用细胞板计数法及CCK8法检测细胞增殖,各组进行统计分析,缺血再灌注72h肾脏匀浆上清对BMSCs的增殖活性最好。3.通过显微镜下观察细胞形态学变化,正常肾脏匀浆上清液、缺血再灌注12h、24h、48h、96h肾脏匀浆上清液干预BMSCs,与缺血再灌注72h肾脏匀浆上清液干预BMSCs相比,缺血再灌注72h组分化的细胞数量最多;阴性对照组BMSCs形态为长梭形样,极少数细胞形态发生变化。4.采用蛋白免疫印迹法及定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)评估检测诱导后CK-18的表达。其中以缺血再灌注72h的肾脏匀浆上清液诱导细胞CK-18的表达最为明显;阴性对照组表达CK-18可能与细胞受外界环境影响发生变化。结论:1.缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆在体外可以诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化。2.肾脏缺血再灌注时间不同,存在不同的损伤微环境。3.急性损伤修复过程中可能存在一个有利于干细胞修复的时间点,本实验发现在缺血再灌注72h进行干细胞治疗可能有助于最大程度的发挥干细胞作用。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692.5
【图文】：

BMSCs形态图

流式细胞术对BMSCs表面抗原鉴定

【参考文献】

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本文编号：2713208