2型糖尿病和糖尿病肾病状态下肠道菌群失衡模式研究及血清质谱组学分析

发布时间：2020-06-15 09:09

【摘要】：糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一组以长时间血清葡萄糖升高导致出现各种各样并发症的慢性疾病,主要病因是由于胰岛素缺乏和(或)胰岛素生物作用障碍导致血清葡萄糖代谢出现紊乱,可伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等各种物质代谢障碍,糖尿病可同时并发眼底、肾脏、神经系统及心血管系统等多脏器或多系统出现慢性损害。我国人口基数大是糖尿病大国,根据今年来国际糖尿病联盟(IDF)发布的最新糖尿病数据显示,中国糖尿病患者已达1.14亿人左右,居世界首位。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T_2DM)也叫成人发病型糖尿病,是一种多基因遗传性疾病,发病机制涉及多种原因,包括遗传、环境等因素,其发病原因为胰岛素抵抗和分泌不足,发病年龄多在35~40岁之后发病,占糖尿病患者的90%-95%。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病临床常见的三大并发症之一,在我国的发病率目前呈现出快速发展的趋势,已经成为终末期肾脏疾病非常重要的病因,仅次于临床各种病因导致的肾小球肾炎。1型糖尿病病人出现糖尿病肾病并发症大多在起病10~15年左右,而2型糖尿病病人发生糖尿病肾病的时间则更短,可能与年龄大同时合并较多其他基础疾病有关。近年来肠道菌群的研究越来越受到人们的关注,诸多证据表明,肠道菌群在人类多种复杂疾病的发生、发展中发挥着重要作用,大量科学研究表明,健康和环境因素与肠道菌群的构成和功能变化相关,肠道菌群的可修饰性可能有助于疾病的预防和治疗。肠道菌群与糖尿病关系密切,肠道菌群可以影响机体对糖类及能量的吸收,促进脂肪的合成及存储,肠道屏障功能障碍为细菌内毒素入侵机体血液提供了可能的途径,从而可能诱发低度炎症及胰岛素抵抗,中国人群研究显示糖尿病患者肠道菌群较健康对照组显著改变,与血糖代谢明显相关,表现为有益菌比例降低及菌种多样性的减少而潜在致病菌增多。飞行时间质谱是一种能够分析血清、尿液、唾液、组织等多种复杂样品的技术,随着技术的成熟及分析成本的降低,飞行时间质谱在基因分型分析、生物标志物鉴定、病原体鉴定、质谱成像等方面得到广泛的应用,质谱技术的发展为我们进一步研究糖尿病和糖尿病肾病患者的蛋白组学和多肽组学的变化提供了一种有效的途径。研究目的和意义观察2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T_2DM)和糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)患者相对于健康对照人群肠道菌群失衡模式及功能变化,寻找两种疾病患者肠道菌群一致和特异性的变化信号并分析肠道菌群与血清炎症指标间的关系,同时探究T_2DM和DN患者血清蛋白及多肽组学的特征。其意义在于分析两种疾病状态下肠道菌群的失衡模式及功能变化,尝试找出促使T_2DM病患者进展为T_2DM的关键危险菌株,同时建立通过肠道菌群区分T_2DM和DN患者的分类算法模型,并通过网络分析探究对T_2DM和DN患者肠道生态系统最具影响力的类群;通过血清质谱组学分析,建立T_2DM和DN患者的诊断模型及鉴别诊断模型,尝试提出一种新的疾病诊断方法。研究方法1.以南方医科大学珠江医院住院部患者为研究对象,选取2型糖尿病患者30例,糖尿病肾病患者25例,另外选取正常体检者30例作为对照,采集静脉血同时收集患者入院后48小时内粪便标本。2.采用Illumina高通量测序技术对粪便样本中所有细菌的16SrDNA-V4区进行DNA测序,使用QIIME(v1.9.1)对原始序列进行处理、分析。与Greengenes(v13_8)数据库进行对比,按照97%的一致性操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类,分析菌群结构及菌群多样性。3.采用Roche E601分析仪及配套试剂测定血清IL-6,采用SIEMENS BNP分析仪及配套试剂测定血清CRP,统计分析两种疾病与对照组差异。4.采用飞行质谱仪Quan TOF(青岛融智生物)对去除蛋白后的血清样本在1000-10000范围内的m/z值进行检测,并使用PCoA(主成分分析)分析各组数据,随机森林建立模型。统计方法采用R 3.3.2软件与SPSS20.0作数据统计。组间年龄比较运用t检验,性别构成比运用Χ2检验,组间非参数检验用Wilcoxon秩和检验,大于两组的非参数资料用kruskal waills检验,PCoA统计学分析方法使用Adonis，R软件作图。P0.05为差异有统计学意义。研究结果2型糖尿病和糖尿病肾病患者肠道菌群多样性与健康对照组明显不同(P0.05)。T_2DM和DN组肠道有较多一致的变化信号,如毛螺旋菌属、柔嫩梭菌属、罗斯氏菌属和粪球菌属显著下降(P0.05),但两者间也存在疾病特异性的菌群失衡模式,T_2DM患者Bacteroides显著增多,DN患者Lactobacillus,Slackia，Anaerotruncus，Haemophilus和Enterococcus显著增多。功能预测也证实,T_2DM和DN患者肠道有较多一致性功能变化;2型糖尿病和糖尿病肾病组血清炎症指标显著高于健康对照,提示T_2DM和DN有益菌的减少可能是导致血清炎症指标上升的原因;血清质谱组学分析发现2型糖尿病和糖尿病肾病患者血清质谱组学不同于健康对照组,并且2型糖尿病和糖尿病肾病患者血清质谱组学也不相同。研究结论2型糖尿病和糖尿病肾病患者肠道菌群存在一致的变化均为产丁酸菌减少,但两者之间也有疾病特异性的变化,血清质谱组学分析提示使用质谱组学分析的方法区分2型糖尿病、糖尿病肾病和健康对照具有一定的可行性,为进一步研究通过肠道菌群和血清质谱组学方法评估糖尿病患者肾病发生风险提供了数据基础。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

图１－１邋Ｔ２ＤＭ与ＤＮ和健康对照肠道菌群门水平构成（ＤＭ：邋２型糖尿病，ＤＮ：糖尿病肾Ｃ：健康对照）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈｙｌｕｍ邋ｌｅｖｅｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｆｌｏｒａ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｈｅａｌｔｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋（邋ＤＭ：邋Ｄｉａｂｅｔｅｓ邋ｍｅｌｌｉｔｕｓ，邋ＤＮ：邋ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，邋ｃｏｎｔｒｏｌ：邋ｈｅａｌｔｈｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ）逡逑如图二，选用Ｏｂｓｅｒｖｅｄ逦ＯＴＵ和ＰＤ＿ｗｈｏｌｅ＿ｔｒｅｅ指数评估２型糖尿病患者糖尿病肾病患者相对于健康对照组ａ多样性的变化，发现２型糖尿病组和糖病肾病组肠道菌群ａ多样性较健康对照组显著降低（Ｐ＜０．０５），而２型糖尿病糖尿病肾病患者肠道菌群ａ多样性无统计学差异。ＰＤ＿Ｗｈｏｌｅｊｒｅｅ指数显示，逡逑Ｔ２ＤＭ和ＤＮ与健康对照有统计差异，Ｔ２ＤＭ和ＤＮ无统计学差异。逡逑如图三，选用主坐标分析（ＰＣｏＡ）可以观察到２型糖尿病患者和糖尿病病患者是否存在菌群的整体偏移。图中的每个点代表一个样品，点之间的距表示菌群结构的差异，本研究中，我们使用这种方法基于Ｕｎｉｆｒａｃ距离［２４］分析

逦ＰＣ１（２３邋７５５％）逡逑ＡＢＣ逡逑图１－３邋Ｐ多样性对比（Ａ：邋２型糖尿病与健康对照；Ｂ：糖尿病肾病与健康对照；Ｃ：邋２型糖逡逑尿病与糖尿病肾病）逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｆｌｏｒａ邋ｐ邋ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｈｅａｌｔｈｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ邋（Ａ，邋Ｔｙｐｅ邋２邋ｄｉａｂｅｔｅｓ邋ｍｅｌｌｉｔｕｓ邋ｆｒｏｍ邋ｈｅａｌｔｈｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｂ，Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ邋ｆｒｏｍ逡逑ｈｅａｌｔｈｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｃ，Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ邋ｆｒｏｍ邋Ｔｙｐｅ邋２邋ｄｉａｂｅｔｅｓ邋ｍｅｌｌｉｔｕｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．）逡逑２．２邋Ｔ２ＤＭ与ＤＮ患者肠道菌群一致的变化信号与疾病特异性失衡模式逡逑ＬＥｆＳｅ分析各研宄组肠道菌群变化特征，发现２型糖尿病组和糖尿病肾病组逡逑肠道菌群存在很多一致的变化，且这些一致的变化信号多表现为有益菌的减少，逡逑如图四Ａ和Ｃ，在门水平上，厚壁菌门和蓝藻细菌门在糖尿病组和糖尿病肾病逡逑组肠道中显著减少，在属水平上，毛螺旋菌属、ｒｗｈｃ访ａｃｆｅｒ、逡逑柔嫩梭菌属（Ｆａｅｃａ／出）、罗斯氏菌（ｉ？ｏｓｅＺｗ／ａ）和类球菌属（Ｃｏｐｒａｃｏｃｃｗｓ）逡逑在糖尿病组和糖尿病肾病组肠道中显著减少（Ｐ＜０．０５）。科水平上，毛螺旋菌科逡逑（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）在糖尿病和糖尿病肾病患者肠道中显著减少（Ｐ＜０．０５）

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本文编号：2714198