人羊膜间充质干细胞对1型糖尿病大鼠肾脏缺氧相关因子HIF-PHD轴的影响

发布时间：2020-06-15 21:56

【摘要】：背景和目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)被认为是糖尿病进展过程中棘手的临床难题。肾脏微血管异常改变和慢性缺氧与疾病的发生及发展密切相关。目前DN临床治疗效果不佳,干细胞治疗的兴起有望成为DN理想治疗措施。本研究旨在通过糖尿病动物模型实施人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)移植治疗,观察糖尿病肾脏缺氧状态及相关因子表达变化,评估hAMSCs对糖尿病肾脏病变的影响。方法:hAMSCs由遵义医科大学细胞工程重点实验室分离、培养与鉴定,培养P3代细胞后用于移植干预治疗。1型糖尿病大鼠模型建立是通过单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的。随机分选雄性SD大鼠(n=54)共3组,每组18只。其中NC组,PBS腹腔注射代替STZ,另使用PBS静脉注射代替hAMSCs。DN组,模型建立后不经任何措施处理,仅等量PBS阴茎静脉注射代替hAMSCs。MSC组,成模后于3、4W分别给予第三代hAMSC经阴茎静脉缓慢注射。每组又分3个时间点,6W、8W、12W。处死动物前于代谢笼24h饲养大鼠并收集尿液,水合氯醛麻醉并采血、摘取肾脏标本。血液、尿液采集后分别用于检测24h尿蛋白、血糖及肾功能。肾脏标本包埋及-80℃冰冻冷藏,切片后常规HE染色及PAS染色观察肾病理变化,通过检测抗人标记物抗体(MAB1281)用于观察移植细胞肾脏定植,缺氧探针免疫组化检测缺氧面积,免疫组化、免疫荧光、Western Bloting和Real Time-PCR检测检测肾脏缺氧相关指标(HIF-1α、PHD2、HO-1、SDF-1)表达变化。结果:(1)DN组和MSC组不同时间点血糖和24小时尿蛋白均高于NC组(P0.05);同时点的MSC组的血糖、24小时尿蛋白较DN组均不同程度下降,但仅于12W时的差异有显著性(P0.05)。(2)DN组与MSC组的血肌酐于各个时间点均不同程度高于NC组;MSC组6?12W的血尿素水平均低于DN组(P0.05)。(3)病理组织学显示DN组和MSC组的肾重指数升高,伴有肾小球肥大、系膜基质增多、肾小管基底膜有增厚;胰岛结构损害,胰岛细胞消失萎缩、坏死并伴炎性细胞浸润,其中MSC组肾脏、胰腺损伤程度相对减轻。(4)免疫荧光观察到MAB1281于各时点MSCs组的肾脏组织均有分布,而DN及NC组未发现。(5)缺氧探针免疫组化染色结果发现NC组在髓内与皮质交界处有阳性染区,而DN组阳性范围扩大到皮质且着色更深,DN组缺氧面积明显高于MSC组(P0.05)。(6)免疫组化或荧光及蛋白免疫印迹观察显示HIF-1ɑ、PHD2、HO-1与SDF-1主要表达于肾小管细胞以及部分肾小球细胞;DN组与MSC组肾组织各时点HIF-1ɑ、PHD2、HO-1与SDF-1的表达较NC组均明显上调(P0.05);MSC组在相同时间点HIF-1、HO-1和SDF-1表达明显高于DN组(P0.05),而PHD2的表达较DN组下调(P0.05)(7)RT-PCR结果显示DN组及MSC组肾组织HIF-1ɑ、PHD2、HO-1与SDF-1mRNA表达于各时点均不同程度高于NC组;同时点的MSC组的HIF-1ɑ、HO-1和SDF-1 mRNA表达较DN组不同程度上调,并分别于8W和12W、6W和8W、6W和12W时表达差异有显着性(P0.05);MSC组的PHD2的mRNA于各时点表达较DN组下调,但只有6W与12W时差异有显著性(P0.05)。结论:慢性缺氧存在于STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中并参与肾脏病变进程,移植hAMSCs可缓解糖尿病大鼠肾脏所存在的缺氧状态,减轻肾脏病变且这些影响可能与hAMSCs移植改善HIF-PHD缺氧反应轴的相关因子表达有关。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

大鼠,表观,毛质,精神状态

遵义医科大学硕士学位论文李少斌2 结果2.1 大鼠表观情况NC 组大鼠体形匀称，精力旺盛且饮食状况良好，动作及反应灵敏，毛发平整光滑。DN 组中糖尿病大鼠主要表现为一般情况差，可见萎靡不振，毛质粗糙，动作及反应迟缓，身体弓背挛缩。MSC 组大鼠也具有糖尿病典型症状，但精神状态较DN 组有所改善（见图 1）。

尿蛋白,大鼠,检测结果

Groups 6W 8W 12WNC 7.65±0.25 7.40±0.40 10.57±0.25DN 47.90±4.51*43.39±3.44*35.81±0.89*MSC 42.76±5.99*38.81±3.72*28.64±0.51*△Note: vs group NC, * P＜0.05; vs group DN,△P＜0.05表 6-2 观察大鼠 24h 尿蛋白变化（ x ±s，n=6，mg/24h ）Table.6-2 The results of 24h urine protein in rats were observed（ x ±s，n=6 ,mg/24h）Groups 6W 8W 12WNC 10.15±3.26 5.24±0.63 6.20±1.23DN 67.60±17.90*32.70±6.35*59.73±7.98*MSC 53.85±14.62*28.47±4.01*33.25±2.49*△Note: vs group NC, * P＜0.05; vs group DN,△P＜0.05

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